A hosszú távú, magas fehérjetartalmú étrend jelentősen csökkenti a zsírszövetet nagyobb mellékhatások nélkül Wistar hím patkányokban

Absztrakt

annak az epidemiológiai bizonyítéknak a ellenére, hogy a fehérjebevitel három évtized óta nőtt az iparosodott országokban (25, 66), és az ajánlott bevitel körülbelül kétszerese (72), a magas fehérjetartalmú étrend lehetséges káros hatásainak kérdése továbbra is vitatott . Ma már jól bebizonyosodott, hogy a HP diéták korai markáns anyagcsereváltozásokat váltanak ki az emberi és állati modellekben, különösen akkor, ha az étrend legalább 50% energiát tartalmaz fehérjeként (13, 17, 40, 42). Mindazonáltal a hosszú távú HP diéta fiziológiai és funkcionális következményeit nem vizsgálták teljes mértékben.

A túlsúly és az elhízás elterjedtsége miatt, különösen a nyugati országokban (41), a HP diétákat gyakran alternatív és sikeres stratégiának tekintik a hatékony és hosszú távú fogyás végrehajtására (62). Valójában a HP diétákról jelenleg ismert, hogy táplálkozást gátló hatást váltanak ki patkányokban (5, 46) és emberekben (30, 70). Az alacsony kalóriatartalmú, magas fehérjetartalmú étrendet sikeresen lehet alkalmazni elhízott alanyok kezelésére (3, 70). A korlátozottan korlátozott étrend fogyókúrás orvosi alkalmazása azonban nem feltétlenül vezet magas mennyiségű fehérjebevitelhez. A spontán étrendi bevitelnél a magas fehérje bevitel hozzájárulása a túlsúly prevalencia csökkentéséhez nem teljesen konszenzusos, mivel két epidemiológiai tanulmány pozitív összefüggést talált a korai gyermekkorban a fehérje bevitel és a corpulence között (52, 64).

A HP diéták feltételezett káros hatásai között gyakran emlegetik a máj- és vesefunkció károsodását, mivel központi szerepet töltenek be a nitrogén-anyagcserében. Kimutatták, hogy a máj és a veseméret patkányokban 2 hét HP táplálkozás után megnő (24, 43). Ezenkívül a glomeruláris szűrési sebességet (GFR) magas fehérjetartalmú bevitel (58, 73) vagy aminosav infúzió (9, 21) növeli, de a vesefunkció ezzel járó károsodása egészséges körülmények között nem bizonyított. A hosszú távú fehérjebevitelről szintén feltételezik, hogy elősegíti az inzulinrezisztenciát (24, 35) és rontja a kortizol szekrécióját (60). Egyéb káros hatások is előrehaladtak, mint például a vizelettel történő kiválasztás növekedése és a csontok esetleges felszívódása (31, 34), az oxidatív stressz fokozása (47) és a méregtelenítő enzimek módosítása (49).

Figyelembe véve a hosszú távú emberi beavatkozási beavatkozások nehézségeit és a magas fehérjetartalmú étrend-hatásokra vonatkozó teljes toxikológiai vizsgálatok hiányát, biokémiai, anatómiai és szövettani paraméterek széles skáláján vizsgáltuk, hogy a HP diéta hosszú távú bevitele elhízásra hajlamos patkánytörzsben káros és/vagy jótékony hatásai lehetnek. Erre a célra hím Wistar patkányoknak normál fehérje (NP) étrendet vagy HP étrendet adtak 6 hónapig. Részletes testösszetétel, az oxidatív stressz biomarkerei [redukált (GSH) és oxidált (GSSG) glutation, tiobarbitursav-reaktív anyagok (TBARS), γ-glutamil-cisztein-ligáz (γ-GCL) expressziója] és méregtelenítő funkció [glutation-S-transzferáz (GST)], a plazma hormonokat (inzulin, kortizol és leptin), valamint a máj és a vese hisztopatológiáját vizsgálták. A kalcium egyensúlyt 4 hónap NP vagy HP étrend után is értékeltük.

Állatok és diéták.

Asztal 1. A diéták összetétele

Kísérleti eljárás és mintagyűjtés.

3 és 6 hónap NP-diéta vagy HP-étrend bevitele után, és 1 héttel a halál előtt perifériás vért vettünk az éjszakán át éheztetett patkányok mediális saphena vénájának koponyaágából. A glikémiát azonnal mérjük hordozható refraktométerrel (Encore glükométer; Bayer Diagnostics, Puteaux, Franciaország). Vérmintavétel után a patkányok elfogyasztották rendszeres étkezésüket.

Orális glükóz-tolerancia tesztet egy éjszakai böjt után 12 patkányon végzett kiegészítő vizsgálatban (n = 6/csoport) 3 hónapos kísérlet után. Az éhező patkányok 1 g/kg orális glükózterhelést kaptak, és a vércukorszintet egymás után mérték. Az eredményeket a bazális és a glükóz közötti különbségként fejezzük ki az egyes időpontokban. A kalciumegyensúly számszerűsítéséhez a kísérleti étrend 4 hónapja után a 6 hónapos patkányokat 7 napig külön anyagcsere-ketrecekben tartottuk. A vizeletet és a székletet naponta gyűjtötték; kristályos timolt adtak a vizeletgyűjtő csövekhez, hogy megakadályozzák a baktériumok szaporodását. A mintavételezett vizeletet és a székletet a kísérlet minden napjának végén -20 ° C-on tároltuk.

Analitikai módszerek.

A Carlo Erba-tól (Val de Reuil, Franciaország) vásárolt oldószerek és alkoholok kivételével az összes reagensként használt oldatban vagy pufferben használt vegyi anyagot, valamint az összes enzimatikus vizsgálatot a Sigma-Aldrich Chimie-től (Saint-Quentin Fallavier, Franciaország) szereztük be. A vizelet és a plazma karbamid koncentrációját enzimatikus vizsgálattal (Urea Nitrogen endpoint kit) határoztuk meg; Az albumint a bróm-krezol-lilával reagálták (Albumin kit BCP). A GST aktivitást Habig és munkatársai módszerével mértük. (23) Röviden: a GST konjugálódik 1-klór-2,4-dinitro-benzollal, és az enzimaktivitást ezen aromás szubsztrát jelenlétében spektrofotometriásan határozzuk meg. Az oxidált (GSSG) és a teljes (GSH) glutation esetében a mintákat 9 térfogat 0,9% -os NaCl-oldatban homogenizáltuk. Szűrés után az oldat 50 μl-jét -20 ° C-on fagyasztották a fehérje-kvantitatív elemzések elvégzéséhez, és 300 μl-t vettünk mintából 100 μl 20% -os szulfosalicilsavval keverve és centrifugáltuk (3000 g, 15 perc, 4 ° C). A felülúszót összegyűjtöttük, és a GSH és a GSSG szintjének meghatározásához használtuk Anderson által leírt módszer szerint (2) és TBARS szinteket Satoh technikája szerint (55).

A vizeletben és a székletben (valamint az ivóvízben és az ételben) lévő kalciumszintet lángatomabszorpciós spektrométerrel (SpectrAA 50 modell; Varian, Les Ulis, Franciaország) levegő/acetilén égővel (redukáló láng) határoztuk meg. Az elemzés előtt a folyékony mintákat 1: 100 arányban hígítottuk 5 g/l lantán-kloridot, 1 g/l kalcium-kloridot és 0,2 g/l kálium-kloridot tartalmazó oldatban. A szilárd mintákat (ürülékeket és étrendeket) 2 órán át (100 ° C) melegítve 25 térfogat 2 n salétromsavban mineralizáltuk. A katódlámpa hullámhossza 422,7 nm volt.

A plazmahormonokat RIA kitek segítségével határoztuk meg, nyomjelzőként 125 I-t alkalmazva [INSIK-5 és GammaCoat 125 I Cortisol RIA (Diasorin, Antony, Franciaország) inzulin és kortizol esetében, valamint LEP-R61 (Mediagnost, Tuebingen, Németország) leptinhez]. A nyomjelző radioaktivitását gamma szcintillációs számlálóval (Cobra II Auto-Gamma; Perkin-Elmer) számszerűsítettük.

A plazma homocisztein koncentrációkat kompetitív enzim immunvizsgálattal határoztuk meg, peroxidáz enzimrendszerrel (Axis Homocysteine, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Franciaország).

A vese- és májmintákat az Avicenne-i kórház (Bobigny, Franciaország) szövettani osztályán dolgozták fel. A szöveteket dehidratáltuk és folyékony paraffinba merítettük. A szervmetszeteket (4 μm) a tárgylemezekre illesztettük és HES-sel festettük. A szövettani metszeteket Leica DM LB mikroszkóppal vizsgáltuk (Leica Microsystems, Rueil-Malmaison, Franciaország).

Statisztika.

Az eredményeket átlag ± SE értékekként fejeztük ki. A diéta és az életkor hatásait kétirányú ANOVA-val teszteltük, az SAS általános lineáris modelleljárásával (6.11 verzió: SAS, Cary, NC). A szignifikancia meghatározásához 0,05 α-szintet állítottunk be.

Energiabevitel, testtömeg, testösszetétel és kalcium egyensúly.

Bármi legyen is az étrend, az ételbevitel napról napra változott, de a 6 hónapos időszak alatt nem tapasztaltak elutasítást vagy váratlan csökkenést. Az átlagos napi táplálékfelvétel 6 hónapos kísérlet után szignifikánsan különbözött a HP patkányoktól (348,8 ± 3,1 kJ) és az NP patkányoktól (388,2 ± 6,8 kJ). A HP patkányok energiafogyasztása 87% volt, mint az NP patkányokban. A kísérleti étrend 6 hónapja után a HP patkányoknál a testtömeg jelentős csökkenését figyelték meg az NP patkányokkal összehasonlítva. A HP patkányok tömege az NP patkányoknál tapasztaltak 82% -a volt.

A testtömeg, a WAT és a hasított hasított test súlya az életkor előrehaladtával jelentősen megnőtt (P

2. táblázat. Patkányok testtömege és testösszetétele 3 és 6 hónapos ad libitum fogyasztása után akár NP (14% fehérje), akár HP (50% fehérje) étrend után

Az értékek átlag ± SE. NP, normális fehérje; HP, magas fehérjetartalmú; a lecsupaszított hasított testet megtisztítják, a bőr, a farok, a fej és a végtagok disztális része nélkül. P -1 -1 wk -1 NP, illetve HP patkányokban; P -1 -1 wk -1 NP, illetve HP patkányokban; P -1 -1 wk -1 NP, illetve HP patkányokban; P -1 -1 wk -1 NP, illetve HP patkányokban; nem jelentős).

Plazmahormonok, glükóz, fehérjék, aminosavak és lipidek.

Az éhomi plazma glükóz, inzulin, leptin és kortizol koncentrációja szignifikánsan magasabb volt NP patkányokban, mint HP patkányokban (3. táblázat). Az életkor jelentős hatással volt a vér leptin-, inzulin- és cukorszintjére is, az életkor előrehaladtával drámai módon nőtt a leptin (P

1. ábra.Orális glükóz-tolerancia tesztek patkányokon normál fehérje (NP, fehérje 14%) vagy magas fehérjetartalmú (HP fehérje, 50% fehérje) étrend 3 hónapos ad libitum fogyasztása után.

3. táblázat. Patkányoknál a hormonok, a glükóz, a fehérjék, az aminosavak, a homocisztein, a karbamid, a kreatinin és a lipidek éhomi plazmaszintje 15 nap múlva, 3 hónap és 6 hónap ad libitum fogyasztása mellett NP (14% fehérje) vagy HP (50%) fehérje) diéta

Az értékek átlag ± SE. HDL, nagy sűrűségű lipoprotein. P

4. táblázat. A GSH, a GSSH, a TBARS, a GST aktivitás májszintje 15 nap után 3 hónap és 6 hónap ad libitum fogyasztása akár NP (14% fehérje), akár HP (50% fehérje) étrend után

Az értékek átlag ± SE. TBARS, tiobarbitursavval reakcióképes anyagok; GST, glutation-S-transzferáz. P

2. ábra.A γ-glutamil-cisztein-ligáz (γ-GCL) RT-PCR analízise patkányok májsejtjeiben 3 hónap ad libitum fogyasztása után, akár NP (14% fehérje), akár HP (50% fehérje) étrend után. Ezt az RT-PCR-t specifikus oligonukleotidok és [33P] dATP felhasználásával fejlesztettük ki. A betétek különbözõ patkányok triplikátumainak felelnek meg, amelyek 3 hónapig NP vagy HP étrendet kaptak. A reakciótermékeket agarózgél-elektroforézissel, majd etídium-bromid festéssel analizáltuk. A sor, RT-PCR eredményei patkány májsejtekben a y-GCL amplifikált fragmenséhez (668 pb); B sor, A patkány májsejtjeiben várható β-aktin (353 bp) várható PCR-terméket figyeltek meg.

3 vagy 6 hónapos kísérlet után egyik csoportban sem figyeltek meg súlyos szövettani elváltozásokat. A 3. ábra a máj tipikus szövettani metszeteit mutatja (HES festés). Valamennyi NP patkány szisztematikusan kimutatta a máj mikro- és makrovacuoláris steatosisát, ami valószínűleg túlzott zsírosságukkal volt összefüggésben (3. ábra, A1 és A2). Ezzel szemben a HP patkányokban nem találtak steatosist (3. ábraB). Kisebb, nem patológiás gyulladásos elváltozásokat találtunk a HP csoport két patkányának májában 6 hónap kísérleti étrend után (az adatokat nem mutatjuk be). A 4. ábra a szövettani vese glomerulus metszetét mutatja (PAS festés). A metszetek relatív vastagsága (4 μm) ellenére a fókuszbeállítás lehetővé tette a veseszövetek gondos vizsgálatát. A glomerulusok kapilláris hurkai jól körülhatárolhatóak és vékonyak voltak. Nem volt kimutatható nephrocalcinosis, kollagén sclerosis területe vagy hipercelluláris glomerulus. Az endotheliális és a mesangialis sejtek normálisak voltak, a környező tubulusok is. A PAS-folthoz hasonlóan a vesék HES-foltja (az adatokat nem mutatjuk be) nem mutatott észrevehető elváltozást. Azonban a HP csoport egyik patkánya lokalizált és korlátozott interstitialis limfocita gyulladásos gócot mutatott, egy másik HP patkány kisebb veseműködést mutatott, amely a vesepapilla mérsékelt gyulladására utal (adatokat nem közölünk).

3. ábra.Májszövettani metszetek patkányokban 6 hónapos ad libitum fogyasztás után, akár NP (14% fehérje), akár HP (50% fehérje) étrend után. A1: patkány májszakasza 6 hónap NP diéta fogyasztása után; bemutatott mikrovakuoláris és makrovacuoláris steatosis, amelyet a csoport 8 patkányánál figyeltünk meg. A2: a makrovacuolaris steatosis részlete (vegye figyelembe a sejtmagtól félretolt magot). B: egy patkány májszakasza 6 hónapos HP diéta bevitele után.

4. ábra.Vese szövettani metszetek patkányokban 6 hónap ad libitum fogyasztása után bármelyik NP-ben (a fehérje 14% -a; A) vagy HP (a fehérje 50% -a; B) diéta.

Ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy megbecsülje a magas fehérjeszint hosszú távú bevitelének következményeit egy elhízásra hajlamos patkánytörzsben. Az eredmények azt mutatták, hogy a magas fehérjetartalmú étrend hosszú távú ad libitum fogyasztása jelentősen csökkentette az élelmiszer-bevitelt és csökkentette a WAT-t, több félidős tanulmánynak megfelelően. Egyidejűleg javult a bazális vér inzulin, leptin és triglicerid szintje és a glükóz tolerancia. A nagy mennyiségű tejfehérje bevitel nem befolyásolta a kalcium egyensúlyt. Sőt, az általánosan elfogadottakkal ellentétben a HP diéta káros hatásait nem jelentették, különösen a máj és a vesék hisztopatológiájában.

Sok elhízott és túlsúlyos hiperinsulinémiás emberrel végzett vizsgálat kimutatta a testsúlycsökkenéssel járó bazális plazma koleszterinszint csökkenését, függetlenül az étrend típusától (10, 44). Noha a kazein hiperkoleszterinémiás hatását gyakran gyanítják, különösen egy hüvelyes fehérjeforrással összehasonlítva (22, 38), a keringő koleszterinszint növekedését nem találtuk a HP patkányokban, amelyek háromszor több tejfehérjét fogyasztottak, mint az NP patkányok. Az emberen végzett vizsgálatokkal összhangban (14, 33) beszámoltunk a szérum triacil-glicerin-koncentrációk stabilizálódásáról az életkorral a HP patkányokban, míg a trigliceridek NP-patkányokban 15 napról 6 hónapra nőttek. Ez a különbség valószínűleg a HP diéta alacsonyabb szénhidráttartalmával volt összefüggésben.

Tekintettel a máj és a vesék aminosav- és nitrogén-anyagcserében betöltött szerepére, a HP-diéták feltételezhetően potenciálisan káros hatással lehetnek e szervek szerkezetére és működésére. A májat korán azonosították a karbamid és a glutamin anyagcseréjének főszereplőjeként (32). A karbamidtermelés mértéke lineárisan változik az egészséges felnőttek fehérjebevitelétől (74). Számos enzim, így a treonin-dehidratáz, a transzaminázok és a glutamináz aktivitása drámai módon megnő a HP táplálékkal etetett állatokban (29, 46, 51, 56, 69). A mitokondriális oxidáció növekedése a HP táplálékkal táplált patkányok májsejtjeiben (26, 51) arra a következtetésre vezetett, hogy ezzel az étrenddel fokozódott az oxidatív stressz. Ennek megfelelően az oxidatív aktivitások mérsékelt, de jelentős emelkedését tapasztaltuk, amit a máj GSH szintje és a GST aktivitása tükröz. Az étrend azonban nem befolyásolta a TBARS-t és a γ-GCL expresszióját, és a HP csoportban a GSH értéke fiziológiai tartományban maradt. Eredményeink azt mutatják, hogy a magas fehérjebevitel hatása az oxidatív stresszre ellentmondásos, amint ezt Petzke és mtsai eredményei is szemléltetik. (47), aki 51,3% -os fehérjetartalmú étrend 4 hónapos ad libitum bevétele után nem talált változást a vér vagy a máj GSH-szintjén.

Ezt a vizsgálatot annak feltárására végeztük, hogy a HP diéták hosszú távon károsak lehetnek-e az egészséges állatokra, vagy sem. Szinte lehetetlen lenne egy emberrel egyenértékű periódust végezni. Megállapíthatjuk, hogy hím patkányokban a követelmények háromszorosának megfelelő fehérjebevitel nem okozott káros hatást a vese- és májfunkciókra, az oxidatív stresszre vagy a kalciumegyensúlyra. Éppen ellenkezőleg, a szénhidrátok fehérjékkel történő cseréje előnyös volt a testösszetétel, az alap trigliceridek, a glükóz, a leptin és az inzulin plazmakoncentrációi szempontjából. Jelen tanulmány eredményei egyetértenek azzal az elképzeléssel, hogy a hosszú távú étrendmenedzsment kiemelt fontosságú az elhízás és annak korrelatív X szindróma megelőzésében. További kutatásokra van szükség a súlycsökkenés és a magas fehérjetartalmú cukor glükóz- és lipid-anyagcserére gyakorolt hatásainak meghatározásához.

LÁBJEGYZETEK

A cikk megjelenésének költségeit részben az oldaldíjak megfizetése fedezte. A cikket ezért ezennel fel kell tüntetni:hirdetés”Szerint a 18 U.S.C. Az 1734. § kizárólag ennek a ténynek a feltüntetésére.

Hálásak vagyunk Cecile Bosnak, Ahmed Bensaïdnak, Jean-Christophe Bouthegourdnak és Catherine Luengo-nak az állatok leölésében nyújtott ügyes segítségért, Christiane Larue-Achagiotisnak a leptinvizsgálatokért nyújtott segítségért, valamint Alain Bermondnak az INA-PG Analitikai Kémia Egységétől. segítség a kalcium mérésekhez.