A kínai gyógynövény-képlet, a Shenzhu Tiaopi granulátum metabolikus javulást eredményez a 2-es típusú diabéteszes patkányokban a bél mikrobiotájának modulálásával

1 Endokrinológiai Tanszék, az Anhui Kínai Orvostudományi Egyetem első társult kórháza, Hefei 230031, Kína

2 Diabetes Intézet, Anhui Akadémia Kínai Orvostudomány, Hefei 230012, Kína

3 Fertőző betegség tanszék, az Anhui Kínai Orvostudományi Egyetem első társult kórháza, Hefei 230031, Kína

4 Élettudományi Egyetem, Anhui Egyetem, Hefei 230039, Kína

5 Számítógépes Központ Tanszék, az Anhui Kínai Orvostudományi Egyetem első kapcsolt kórháza, Hefei 230031, Kína

6 Anhui Kínai Orvostudományi Egyetem Műszaki Tanszéke, Hefei 230038, Kína

7 Gyógyszerészeti Tanszék, az Anhui Kínai Orvostudományi Egyetem első kapcsolt kórháza, Hefei 230031, Kína

Absztrakt

Célkitűzés. Ennek a tanulmánynak a célja a kínai gyógynövény-képlet (CHF) Shenzhu tiaopi granulátum (STG) 2-es típusú diabetes mellitusban (T2DM) kifejtett hatásának vizsgálata, és azok mechanizmusainak megvitatása, amelyek révén az STG szabályozza a bél mikrobiotáját. Módszer. A Goto-Kakizaki (GK) patkányokat és az életkornak megfelelő Wistar (W) patkányokat 1 hétig akklimatizáltuk. A GK patkányokat véletlenszerűen 3 csoportra osztottuk, és szájon át sóoldattal (modellcsoport, M), akarbózzal (akarbózcsoport, A) és STG-vel (CHF csoport granulátuma, G; ennek a képletnek a komponense Codonopsis pilosula, Rhizoma Atractylodis, Pinellia, Poria cocos, Pericarpium Citri Reticulatae, Coptis chinensis Franch, és Pueraria). A W patkányokat orálisan sóoldattal (C kontrollcsoport) szoptatták. A megfigyelés ideje 8 hét volt. A súlyt, az éhomi vércukorszintet (FBG) és a vér lipidszintjét teszteltük. A V3-V4 régió 16S rRNS génjeit szekvenáltuk, és elemeztük a bél mikrobiota szerkezetét. Eredmények. A C-hoz képest M jelentős különbségeket mutatott a vércukorszintben, a bél mikrobiotájában stb. (P

1. Bemutatkozás

A közelmúltban néhány tudós felvetette, hogy a bél mikrobiota az emberi test második genomja. A bélmikrobiota összetételéről és egyensúlyáról a jelentések szerint kritikus szerepet játszik az emberi egészségben [1]. A bél mikrobiota működésével kapcsolatos ismereteink nőttek. A bél mikrobiota hozzájárulhat a metabolikus és energia metabolikus diszreguláció kialakulásához [2, 3]. Kimutatták, hogy a 2-es típusú diabetes mellitus (T2DM) összefügg a mikrobiota egyensúlyhiányának kialakulásával és fenntartásával; ezt az egyensúlyhiányt elsősorban a megnövekedett bőség jellemzi Enterococcus, Enterobacter, és Betaproteobacteriumok, valamint csökkent bőségük Bifidobacterium, Lactobacillus, osztály Clostridia, és Faecalibacterium prausnitzii állatkísérletekben [4–7].

Számos tanulmány kimutatta, hogy a bél mikrobiota modulálja a glükóz homoeostasisát a metforminnal, akarbózzal, GLP-1-vel, vildagliptinnel, SGL-2-vel stb. Végzett kezelést követően [8–14]. Az akarbóz gátolja az alfa-glükozidázt a proximális vékonybélben. Hatásmechanizmusa összhangban van a kínai étrend mechanizmusával, ezért az akarbózt széles körben használják Kínában [15]. Benli SU [10] megállapította, hogy az akarbózkezelés növelte a bélbőséget Bifidobacterium longum a T2DM-ben szenvedő kínai betegeknél. Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a bél mikrobiota modulációja hozzájárul az akarbóz által kiváltott vércukorszint-csökkenéshez.

Hosszú évek óta a kínai gyógynövény-tápszereket (CHF) számos betegség, például cukorbetegség kezelésére használják. Számos tanulmány kimutatta, hogy a CHF hatékonyan csökkenti a vércukorszintet és a glikált hemoglobin A1c (HbA1c) szintet T2DM és prediabéteszes betegeknél [16–19]. Korábbi kutatásaink során a Shenzhu tiaopi granulátumot (STG), amely CHF, prediabetikus és T2DM betegeknél tesztelték. Az STG kimutatta, hogy megakadályozza az inzulinrezisztenciát és csökkenti a HbA1c aktivitást [19]. Az azonban továbbra sem világos, hogy a bél mikrobiota összetétele részt vesz-e az STG által közvetített vércukorszint-szabályozásban. Ezért ebben a tanulmányban a CHF STG lehetséges metabolikus javulását és a bél mikrobiota moduláló aktivitását vizsgálták.

2. Módszerek és anyagok

2.1. Állatkísérletek

2.2. Mintagyűjtés és mérés

8 hét után az állatokat nátrium-pentobarbitállal (60 mg/kg) altattuk, és a vérmintákat hasi aorta szúrásmintavétel útján vettük, hogy izolált szérumot kapjunk centrifugálással 4000 fordulat/perc sebességgel 10 percig. Ezután összegyűjtöttük a vastagbél tartalmát.

A testtömeget hetente mértük. A patkányok FBG, triglicerid (TG), összkoleszterin (TC), nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin (HDL-C) és alacsony sűrűségű lipoprotein koleszterin (LDL-C) szintjét automatikus biokémiai analizátorral (Olympus AU640) határozták meg. ).

2.3. Illumina MiSeq bél mikrobiota piroszekvenálása

Az összes szekvenciát SRP091598 regisztrációs szám alatt a GenBankhoz küldték. A 20-nál alacsonyabb átlagos Phred-pontszámú szekvenciákat, a kétértelmű bázisokat tartalmazó szekvenciákat és a 150 bp-nél rövidebb szekvenciákat eltávolítottuk. A páros végű leolvasásokat a FLASH [20] segítségével állítottuk össze. A 10 bp-nél hosszabb effektív szekvencia átfedéseket anélkül, hogy a primerek eltérnének, az átfedés szekvenciájuk szerint állítottuk össze. Az OTU taxonómiai besorolást a BLAST végezte el a reprezentatív szekvenciákon a Greengene Database [21] alapján a legjobb találat [22] felhasználásával. A levágott szekvenciákat feltöltöttük a Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME, v1.8.0) oldalba további elemzés céljából.

2.4. Statisztika és elemzés

Valamennyi adatot az átlag átlag ± standard hibájaként fejezzük ki, és egyirányú varianciaanalízisnek (ANOVA) vagy Fisher legkevesebb szignifikáns különbségtesztjének (LSD) vetettük alá őket az SPSS 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) alkalmazásával. . A P-érték 1. ábra

A testtömeg összehasonlítása a különböző csoportok között.

Az FBG szintek összehasonlítása a különböző csoportok között.

A TC és HDL szint összehasonlítása a különböző csoportok között.

3.2. A bél mikrobiota közösségi felépítése

A bél mikrobiota közösségében bekövetkezett változások értékeléséhez Illumina MiSeq platformok felhasználásával a négy csoport baktériumainak V4-V5 variábilis régióinak 16S rRNS génszekvenálását végeztük el. Összesen 2 132 752 szekvenciát állítottunk elő, C csoportmintánként átlagosan 49 219 szekvenciával, M csoport mintánként 51 127 szekvenciával, A csoportos mintánként 50 763 szekvenciával és G csoport mintánként 68 116 szekvenciával. Harminchat székletminta szekvencia átlagos hossza 420 volt

460 bázispár (4. ábra). Az eredményeket operatív taxonómiai egységként (OTU) mutatjuk be. Az adatokat 97% -os homológiai cut-off értékkel összevonták a Greengene adatbázissal. Összesen 15 minősített szekvenciát (> 0,001%) csoportosítottunk 3517 bakteriális OTU-ba, és 243 OTU csak a C csoportban, 69 OTU csak az M csoportban, 96 OTU csak az A csoportban, és A G-csoportban 413 OTU-t azonosítottak (5. ábra).

Szekvenciahossz eloszlási térkép.

A négy csoport közös és egyedi OTU -inak Venn-diagramja.

Ritkítás után az összes minta szekvenálási mélységét kiszámítottuk az aktuális szekvenálási mélységként. A Shannon-görbék ritka új fenotípusokat és a sokszínűség nagy részét lefedték (6. ábra). OTU szinten a Shannon index által mért közösséggazdagság az M csoportban szignifikánsan nőtt a C csoportéhoz képest (P 6. ábra

A különböző csoportok Shannon-görbéjének elemzése OTU szinten.

A különböző csoportok Shannon-index elemzése OTU szinten.

Ezt követően elkészítették egy felügyelt PLS-DA modellt, amelyben az M csoportot a C csoporttól PLS1 választotta el, míg a G és A csoportokat az M csoporttól PC2 választotta el (8. ábra). Felügyelet nélküli többváltozós statisztikai módszereket, köztük a PCoA pontszámdiagramokat alkalmaztunk, hogy összehasonlítsuk az OTU-dússág különbségeit az M és C csoportok között QIIME szerint. A diagram minden pontja egy minta bél mikrobiotáját képviseli. Megfigyeltük továbbá, hogy a G és A csoportokban alkalmazott kezelések megváltoztatták az egér belének baktériumszerkezetét a PCoA segítségével. A G csoportok közötti távolság nagyobb volt, mint az A csoportoké. A G és A csoport bélmikrobiota-szerkezete azonban ugyanazt a tendenciát mutatta (9. ábra). A súlyozatlan UniFrac-alapú nem metrikus többdimenziós skálázás (NMDS) a mikrobiota-összetétel egyértelmű csoportosulását mutatta ki minden csoportban a négy csoport között. A G-csoportok mikrobiota-összetételét elkülönítették, amely a többi három csoporttól eltérően csoportosult (10. ábra).

Részleges legkisebb négyzetek diszkrimináns elemzési diagram.

A bél mikrobiota fő koordinációs elemzési pontszáma a négy csoport között.

Nem metrikus többdimenziós méretezési pontszám a mikrobiota súlyozatlan UniFrac távolságai alapján.

3.3. A bélmikrobiota kulcsközösségének modulálása a kezelés után

A bél mikrobiota diverzitás elemzésében talált fő phyla a Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Tenericutes és Actinobacteriumokat tartalmazta, amelyek az összes OTU 73,6% -át, 11,7% -át, 10,0% -át, 2,8% -át és 0,8% -át adták. Az összes mintában a firmicutes volt a leggyakoribb menedékjog, 72,5% -ot (a G csoportban), 71,7% -ot (az A csoportban), 70,9% -ot (az M csoportban) és 81,6% -ot (a C csoportban) (ábra 11.) Az M csoportban a Bacteroidetes relatív bőségének növekedését és a Firmicutes csökkenését észlelték a C csoporthoz képest (P 0,05). Eközben nem volt szignifikáns különbség a G és az A csoport között (P> 0,05). Az M csoporthoz képest a G csoport szignifikánsan dúsított relatív Bacteroidetes bőséget mutatott (P 0,05) (13. ábra).

A bél mikrobiotájának összetett mennyisége a menedékjog szintjén.

A székletmintákban kimutatott bakteriális phyla relatív bősége.

Firmicutes/Bacteroidetes arány a négy csoportban.

Nemzetségi szinten a mikrobiota összetétele a négy csoport között nagyban változott. A relatív bősége Allobaculum, Clostridiales, Ruminococcaceae, Lactobacillus, Az S24-7 és a Desulfovibrionaceae 17,8% -kal, 16,1% -kal, 11,9% -kal, 10,1% -kal, 9,9% -kal és 7,1% -kal járult hozzá a teljes székletmikrobiota populációhoz. Csökkentése Allobaculum és Lactobacillus az M csoportban mutattak ki, összehasonlítva a C csoportéval. Az M csoporthoz képest az A és G csoport szignifikánsan megnövekedett bőséget mutatott (P 14. ábra

A széklet tartalmában kimutatott nemzetségek relatív bősége.

Az LEfSe módszert alkalmaztuk a differenciálisan viszonylag bőséges mikrobiota taxonok és a négy csoport között jelentős különbséggel rendelkező gének számának meghatározása szempontjából. A hisztogram hossza jelzi a különböző szervezetek hatásának mértékét. A nem paraméteres faktoriális Kruskal-Wallis rangösszeg teszt alfa értéke elért szignifikáns 2,0-t. A szignifikánsan különböző fajok relatív bőségét az LEfSe eredmények alapján határoztuk meg (P 15. ábra

A bél mikrobiotájának LEfSe összehasonlítása a négy csoport között.

A négy csoport LEfSe elemzéséből származó taxonómiai kladogram. A sárga csomópontok nem jelentenek szignifikáns különbséget a csoportok között. A vörös és a zöld csomópont jelentős csoportok közötti különbségeket jelez.

Az A- és a G-csoportot összehasonlító LEfSe elemzésből nyert taxonómiai kladogram. A sárga csomópontok nem jelentenek szignifikáns különbséget a csoportok között. A piros és a zöld csomópont a csoportok közötti különbségeket jelzi.

A széklet mikrobiota közösség változásainak további azonosításához a diabétesz patkány modellben 50 relatív bőségű nemzetséget mutattak be hőtérképpel, és a nemzetség szintjén csoportosultak. Nyilvánvaló, hogy a nemzetségeket különböző szinteken figyelték meg a négy csoportban. Pszichrobakter, Coprobacillus, Finegoldia, Epulopisclum, Dehalcbacterium, Rothia, Turicibacter, Trichococcus, Streptococcus, Smb53, Desulfovibrio, Anaerostipes, Collinsella, Actinomyces, Staphylococcus, Dorea, Jeotgalicoccus, és Anaerofustis az M csoportban nőttek, míg a Akkermansia, Alistipák, Ruminococcus, Coprococcus, Clostridium, Paraprevotella, és Lachnospira csökkentek (1. táblázat). Az A és G csoport fordított változást mutat ezekben a fajokban. Így a mikrobióta fajok relatív bőségének hőtérképe, amelyet a kezelés megváltoztatott a G csoportban, megmutatja a bélbaktériumok összetételének különbségeit az A csoportéhoz képest. A hőtérkép azt mutatja, hogy a G-csoport szorosabban kapcsolódott a C-csoporthoz, mint az A-csoport (18. ábra).

A széklet hőtérképe a nemzetség szintjén. A piros és a zöld szín az adott rangsorban besorolt olvasások százalékos arányának magas és alacsony értékét jelzi.