A Xiaotan Tongfu főzet hatása a máj metasztázisára az elhízással összefüggő vastagbélrákban

Cikk információk

* Az első két szerző egyformán járult hozzá.

Pinkang Wei, Hagyományos Kínai Orvostudományi Tanszék, Changzheng Kórház, Haditengerészeti Orvostudományi Egyetem (Második Katonai Orvostudományi Egyetem), No. 415 Fengyang Road, Sanghaj 200003, Kína. E-mail: [e-mail védett]

Absztrakt

Célkitűzés

Ezt a tanulmányt az elhízás kolorektális rákra (CRC) gyakorolt hatásának felmérésére és a Xiaotan Tongfu (XTTF) főzet CRC kezelésre gyakorolt hatásának vizsgálatára végezték.

Mód

BALB/C egereket használtak az elhízáshoz kapcsolódó CRC modell létrehozására magas zsírtartalmú étrend és tumor beültetés útján. A tumorokat CT26 sejt szuszpenzióval beoltott egerekből gyűjtöttük be. Testtömeg, májsúly, májmetasztázis és szövettani változásokat figyeltek meg. Immunhisztokémiai elemzést és valós idejű polimeráz láncreakciót végeztünk az inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1), az IGF-1 receptor (IGF-1R) és az IGF-kötő fehérje 3 (IGFBP-3) szintjének mérésére.

Eredmények

Az elhízás befolyásolta az IGF-ek szekrécióját és súlyosbította a CRC-t, míg az XTTF főzet gátolta a máj metasztázisának folyamatát a CRC-ben az IGF-1/IGF-1R szekréciójának szabályozásával és az IGFBP-3 szekréciójának alacsony szintű szabályozásával.

Következtetések

Ez a tanulmány bizonyítékot szolgáltat arra vonatkozóan, hogy az XTTF főzet jelölt gyógyító kezelésként szolgálhat a CRC számára.

Bevezetés

A vastagbélrák (CRC) a férfiaknál a harmadik leggyakrabban diagnosztizált rák, a nőknél a második, és rossz prognózisa van, magas halálozási arány mellett. 1 A CRC magas aránya a „nyugatiasított” országokban azt jelzi, hogy a környezet vagy az életmód, különösen a nagy energiájú ételek fogyasztása és a testmozgás hiánya, alapvető szerepet játszhat a CRC etiológiájában.

Az epidemiológiai bizonyítékok folyamatosan pozitív összefüggést mutatnak az elhízás és a CRC között; az ökológiai adatok azt mutatják, hogy magas a CRC aránya azokban az országokban, ahol az elhízás magas. 2 Bár meggyőző bizonyíték áll rendelkezésre az elhízás és a CRC kockázatának összekapcsolására, a mögöttes biológiai mechanizmusokat még nem sikerült teljesen tisztázni. 3 A tumor progressziójának folyamatához kapcsolódó jelátviteli utak többsége olyan transzkripciós faktorokra összpontosít, amelyek alapvetően igazítják a gyulladás, az angiogenezis és a tumor metasztázisának stimulálásában szerepet játszó gének expresszióját. 4 Az elhízás által kiváltott inzulinrezisztencia, adipokinek és krónikus gyulladás kulcsszerepet játszhatnak a colorectalis carcinogenesis összetett metabolikus útvonalaiban. 2 Bizonyító bizonyítékok arra utalnak, hogy az inzulinszerű növekedési faktor 1 (IGF-1) összefügg a CRC-vel, és az IGF-1 magasabb szintje a CRC megnövekedett kockázatával függ össze. 5 A műtét, a kemoterápia és a sugárterápia jelenleg a CRC-terápia alappillére; e terápiák káros hatásait azonban nem lehet figyelmen kívül hagyni. Újszerű vagy további, biztonságosabb kezelési módszerekre van szükség.

A hagyományos kínai orvoslást (TCM) széles körben alkalmazták, és hatékonynak bizonyult a CRC kezelésében. 6,7 A TCM különféle típusainak vizsgálata alapján elkészítettük a Xiaotan Tongfu (XTTF) főzetet, amelynek összetett összetétele van és funkcióit elsősorban Pinelliae rizóma, Citrus reticulata Blanco, és Poria, mint a CRC kezelésének hatékony megközelítése. Korábbi tanulmányok azt sugallták Pinelliae rizóma nyilvánvalóan gátolja a petefészekrák SKOV3 sejtjeinek növekedését. 8 Nobiletin, a Citrus reticulata Blanco, megerősítették, hogy elnyomja a vastagbél többféle sejtjének szaporodását és invázióját. 9 Pachiminsav Poria jelentős rákellenes aktivitással rendelkezik a sejttenyészetben, és a mitokondriális diszfunkció révén apoptózist indíthat a prosztatarák sejtjeiben. 10 E megállapítások alapján feltételeztük, hogy az XTTF főzet alkalmazható a CRC kezelésében.

Ebben a tanulmányban feltételeztük, hogy az elhízás pozitívan befolyásolja a CRC-t, míg az XTTF főzet hatékonyan enyhítheti a CRC-t a máj metasztázisának megzavarásával. Úgy véltük, hogy hatásmechanizmusa magában foglalhat olyan IGF-eket, mint például az IGF-1, az IGF-1 receptor (IGF-1R) és az IGF-kötő fehérje 3 (IGFBP-3). Az XTTF főzet értékes lehet a CRC kezelésében.

Mód

Anyagok

Az XTTF főzet összetevőit a Shanghai Ley's Pharmaceutical Co., Ltd.-től (Sanghaj, Kína) vásárolták, a főzetet a Changzheng Kórházban gyártották. Az IGF-1, IGF-1R és IGFBP-3 elleni antitesteket Abcam-tól (Cambridge, Egyesült Királyság) szereztük be. A Trizol reagenst és a transzkripciós reagenseket a JRDUN Biotechnology Company-tól (Sanghaj, Kína) szereztük be.

Sejtkultúra

Egér vastagbélrák CT26-sejteket a Shanghai Cells Center-től, a Kínai Tudományos Akadémiától (Sanghaj, Kína) vásároltunk. A sejteket 25% magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI-1640 táptalajban (GIBCO, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) tenyésztettük (Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd., Hangzhou, Kína), és 37 ° C-on inkubáltuk. 5% szén-dioxid atmoszférában.

Állatok

A 6–8 hetes, 18–20 g tömegű hím BALB/C egereket a Kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína) Állatkísérleti Központjától vásároltuk. Az egereket a kísérlet előtt 1 hétig kórokozótól mentes állatállományban tartottuk. Valamennyi kísérletet a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó irányelveknek megfelelően végeztük. Az összes elvégzett kísérleti műveletet a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. intézményi felülvizsgálati tanácsa jóváhagyta.

A magas zsírtartalmú CRC májmetasztázis-modell létrehozása egerekben

Az elhízással összefüggő CRC eredményeinek optimalizálása érdekében ebben a vizsgálatban az állatkísérleteket két részre osztottuk.

1. rész: Az egereket véletlenszerűen két táplálkozási csoportra osztottuk (n = 20 mindegyik): rendszeres étrenddel és magas zsírtartalmú étrenddel. Tizenkét héttel a takarmányozás kezdete után az egereket szubkután oltottuk be a jobb oldali hónaljban összesen 1,0 × 108 CT26-sejttel az implantációs tumorok kialakulása érdekében. A szövettanilag ép tumorszövetet ezután összegyűjtötték és beültették az egerek vastagbélfalába, hogy létrehozzák a humán CRC-hez hasonló modellt. Az összes egeret négy csoportra osztottuk (mindegyik n = 8) az alábbiak szerint: a szabályos kontrollcsoportot (R-C csoport), rendszeres táplálékkal etettük; a zsírkontroll csoport (F-C csoport), zsírtartalmú étrenddel táplálva; a rendszeres modellcsoport (R-M csoport), rendszeres étrendet tápláltak és tumor beültetésnek vetették alá; és a zsírmodell-csoport (F-M csoport), magas zsírtartalmú étrendet tápláltak és tumor beültetésnek vetették alá.

2. rész: Az elhízással összefüggő CRC modell létrehozásához az 1. részben leírtakkal megegyező előzetes kezelést hajtottak végre, és az összes egeret három csoportra osztották (mindegyik n = 8): a kontroll csoportra, kezeletlenül és rendszeres táplálékkal etették; a modellcsoport magas zsírtartalmú étrenddel etetett és tumor beültetésnek vetették alá; és az XTTF csoport magas zsírtartalmú étrendet táplált, tumor beültetésnek vetették alá, majd XTTF főzettel (3,536 mg/(g.d), naponta egyszer) kezelték.

Valamennyi egeret folyamatosan ugyanazzal a rendszeres táplálékkal etették. 4 hét elteltével az összes egeret gerinc kimozdulásával elöltük.

Szövettani elemzés és immunhisztokémiai (IHC) elemzés

A májszöveteket 10% foszfáttal pufferolt formalinban rögzítettük, paraffinba ágyazottuk és 5 μm-nél metszettük. Ezután a metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festették. A tárgylemezeket mikroszkóppal figyeltük meg és fényképeztük le (Olympus BH2; Olympus, Tokió, Japán).

A formalinban rögzített és paraffinba ágyazott szövetmintákból nyert 5 μm vastag metszeteket rendszeresen viaszmentesítettük és rehidratáltuk, majd endogén peroxidáz blokkolást végeztünk. A metszeteket 20% -os kecskeszérum-albuminnal (Dako, Glostrup, Dánia) blokkoltuk, majd 2 órán át inkubáltuk IGF-1, IGF-1R és IGFBP-3 antitestekkel. Ezután a metszeteket HRP-R/M-mel (Dako) inkubáltuk 30 percig a gyártó utasításainak megfelelően, és hematoxilinnal ellenfestettük. A pozitív eredményeket barnára festettük és × 400-as nagyítással számoltuk.

RNS extrakció és valós idejű polimeráz láncreakció

A teljes RNS-t a májból Trizol reagens alkalmazásával izoláltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Az RNS-t reverz-transzkripcióval cDNS-be fordítottuk, és a reverz transzkriptáz-terméket génspecifikus primerpárokkal amplifikáltuk; glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenázt használtunk normalizáló kontrollként. A detektáláshoz használt primereket (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) az 1. táblázat mutatja. Az amplifikációs körülmények a következők voltak: 40 ciklus 2 perc elő denaturációval 94 ° C-on és 25 s denaturációval 94 ° C-on. C, majd 30 s izzítás. A reakciókat két példányban hajtottuk végre, és az adatokat 2 - △△ Ct módszerrel elemeztük. 11.

1. táblázat: PCR primerek a kimutatáshoz.

Statisztikai analízis

A varianciaanalízist az SPSS 16.0 változat (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) segítségével végeztük. Az értékeket átlag ± szórásként adjuk meg. A csoportok közötti statisztikai szignifikanciát Student t-tesztjével vagy egyirányú varianciaanalízissel határoztuk meg. A ≤0,05 p értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

Etika

Minden állatkísérletet a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. etikai irányelvei szerint hajtottak végre; A Kínai Tudományos Akadémia Sanghaji Laboratóriumi Állatközpontja; és a „3R” elv. Minden erőfeszítést megtettünk az állatok szenvedésének minimalizálása érdekében. A kutatási projektet a Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. és a Kínai Tudományos Akadémia Sanghaji Laboratóriumi Állatközpontja hagyta jóvá.

Eredmények

Az elhízás növeli a szilárd daganatok és a máj metasztázisainak növekedését a CRC-ben

1. ábra Az elhízás növeli a szilárd daganatok és a máj áttétek növekedését a CRC-ben. a) A magas zsírtartalmú étrend elhízást váltott ki a BALB/C egerekben. *** o

Az elhízás szabályozza az IGF-1 és az IGF-1R fehérje expresszióját és mRNS-szintjét, és csökkenti az IGFBP-3 szintjét a CRC-ben

Az IGF-ek szintje szorosan összefügg a CRC megnövekedett kockázatával. A 2. a) ábra mutatja, hogy az IGF-1 fehérje expressziója magasabb volt az R-M és az F-C csoportokban, mint az R-C csoportban, és az F-M csoportban volt a legmagasabb. Az IGF-1 mRNS-szintje szignifikánsan jobb volt az F-M-ben, mint az R-C-csoportban (p 2. ábra (d)). Ugyanezeket az eredményeket kaptuk az IGF-1R esetében is (2. ábra (b), (e) ábra). Az IGFBP-3 szint alacsonyabb volt az R-M és az F-C csoportokban, mint az R-C csoportban, és a legalacsonyabb volt az F-M csoportban (2. ábra (c), (f)). Ezek a megállapítások azt sugallják, hogy az elhízás és a CRC bizonyos mértékben befolyásolja az IGF-szintet, és hogy az elhízás elősegítheti az IGF-1 és az IGF-1R fehérje-expressziójának és mRNS-szintjének újraszabályozását, miközben az IGFBP-3 ezen szintjeit szabályozza, így pozitív hatás a CRC-re.

2. ábra Az elhízás hatása a BALB/C egerek IGF-1, IGF-1R és IGFBP-3 fehérje expressziójára és mRNS szintjére. Az (a) IGF-1, (b) IGF-1R és (c) IGFBP-3 fehérje expresszióját immunhisztokémiai elemzést követően számszerűsítettük. A (d) IGF-1, (e) IGF-1R és (f) IGFBP-3 mRNS szintjét valós idejű polimeráz láncreakcióval detektáltuk. Az átlag ± szórást alkalmaztuk az ábrán szereplő adatok SPSS szoftverrel történő megszerzéséhez. * o

Az XTTF főzet jelentősen megnöveli az egerek testtömegét és gátolja a szilárd daganatok növekedését

Az XTTF főzetet 3,536 mg/(g.d) dózisban adtuk be, hogy értékeljük a főzet CRC-re gyakorolt gyógyító hatását. Az egerek leölése után megfigyeltük, hogy a daganatok folyamatosan nőttek, és hogy a végső daganatok láthatóan nagyobbak voltak a modellcsoportban, mint a többi csoportban. Amint a 3. (a) ábra mutatja, az XTTF csoportba tartozó egerek szignifikánsan nagyobb testtömeget mutattak, mint a modellcsoportban (p 3. ábra (c)). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az XTTF főzet javíthatja a testsúlycsökkenést és csökkentheti a CRC tumor növekedését egerekben.

3. ábra. Az XTTF főzet gátolja a daganat növekedését és a májáttéteket az elhízással összefüggő vastagbélrákban. Az egerek testtömegének és (b) tumorszakaszának változásai a modellcsoportban az XTTF főzet beadása után. (c) Az XTTF főzet jelentősen csökkentette a tumor súlyát és a máj metasztatikus szövetének méretét. Az átlag ± szórást alkalmaztuk az ábrán szereplő adatok SPSS szoftverrel történő megszerzéséhez. ** o

Az XTTF főzet elnyomja a CRC májáttéteit egerekben

Amint a 3. ábra (d) ábrán látható, több fehér csomót figyeltünk meg a máj felületén a modellcsoportban, míg az XTTF csoportban kevés ilyen csomót találtunk. Mikroszkóp alatt (3. ábra (b)) a máj lebeny szerkezete jelentősen károsodott, normális májszövet nem volt látható. A legtöbb szövet nekrotikus volt, és számos metasztatikus ráksejt behatolását figyelték meg. A citoplazma kicsi volt és összeomlott, és ez a megállapítás szorosan összefüggött a rákcsomók makroszkopikus kialakulásával. Az XTTF csoportban a máj lebeny szerkezete viszonylag integrálódott, csak néhány rákos sejt enyhe beszivárgásával. A szövettani elemzés szerint az XTTF főzet hatékonyan képes elnyomni a CRC májáttéteit BALB/C egerekben.

Az XTTF főzet csökkenti az IGF-1 és az IGF-1R fehérje expresszióját és mRNS-szintjét, és az egerekben a CRC májmetasztázisaiban upregulálja az IGFBP-3-t.

Annak megállapítására, hogy az XTTF főzet pozitív hatással van-e a máj metasztázisaira az IGF rendszeren keresztül, IHC analízist és valós idejű polimeráz láncreakciót alkalmaztak az IGF-1, IGF-1R és IGFBP- fehérje expressziójának és mRNS-szintjének kimutatására. 3 májáttétekben.

4. ábra: Az XTTF főzet hatása az IGF-1, IGF-1R és IGFBP-3 fehérje expressziójára és mRNS szintjére az elhízással összefüggő vastagbélrákban. Az (a) IGF-1, (b) IGF-1R és (c) IGFBP-3 fehérje expresszióját immunhisztokémiai elemzést követően számszerűsítettük. A (d) IGF-1, (e) IGF-1R és (f) IGFBP-3 mRNS szintjét valós idejű polimeráz láncreakcióval detektáltuk. Az átlag ± szórást alkalmaztuk az ábrán szereplő adatok SPSS szoftverrel történő megszerzéséhez. ** p ## p ### p

A 4. ábra d) és e) ábráján bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az IGF-1 és az IGF-1R mRNS szintje nyilvánvalóan alacsonyabb volt az XTTF csoportban, mint a modell csoportban, míg az IGFBP-3 mRNS szintje szignifikánsan megnőtt az XTTF csoportban (p 12–14 2 hét után nyilvánvaló csomók képződtek és folyamatosan nőttek a vizsgálati időszak alatt. Ez az eredmény azt jelezte, hogy sikeresen létrehoztunk egy egyszerű és reprodukálható CRC modellt, magas májmetasztázisos gyakorisággal.

Egyre több kutatás mutatja, hogy az IGF-ek kulcsfontosságú célpontok a rák terápiájában. Az IGF-1, egy fontos mitogén faktor, az inzulinrezisztencia által aktiválódik. Elősegítheti a sejtek proliferációját és gátolhatja a sejtek apoptózisát. 15 Az IGF-1 kombinálódik az IGF-1R-rel, és mind az autokrin, mind a parakrin funkciókat ellátja. Az IGFBP-3, egy növekedési faktor, amely elősegíti a sejtek apoptózisát, kompetitíven kötődik az IGF-1R-hez és funkcionál az IGF-1 befogadásával vagy akár az IGF -ektől független funkciókkal. 16 IGFBP komplexet képezhet az IGF-1-gyel, amit a rendelkezésre álló szabad IGF-1 mennyiségének csökkenése és az IGF-1 által közvetített DNS-szintézis csökkenése kísér. Az elhízás, különösen a hasi zsír, az inzulinrezisztencia elsődleges oka. Az elhízás okozta hiperinsulinémia fokozhatja az IGF-1 májszintézisét és csökkentheti az IGFBP szekrécióját, ami javítja a keringő IGF-1 szintjét. 12 Jelen tanulmányban az IGF-1 és az IGF-1R szintje javult és az IGFBP-3 szintje csökkent a modellcsoportban, bizonyítva, hogy szoros összefüggés van az elhízás és a CRC között, valamint annak a lehetősége, hogy az elhízás elősegíti a májműködést metasztázis a CRC folyamatában.

Ezenkívül egy tanulmányban az IGF-1 mRNS szintje humán vastagbélrák mintákban állítólag 3-5-szer magasabb volt, mint a normál vastagbél hámjában. 19 Egérkísérletek azt is kimutatták, hogy az IGF-1 mennyiségének és az IGF-1R aktivitásának csökkenése a szövetben vagy a vérkeringésben gátolhatja a CRC sejtek növekedését. 20,21 Jelen vizsgálatunkban az XTTF főzetet alkalmaztuk az elhízással összefüggő CRC kezelésére egerekben. A kezelt csoport egereinek fizikai állapota és májindexe sokkal jobb volt. Az XTTF főzet jelentősen csökkentette az IGF-1 és az IGF-1R aktivitását, és nyilvánvalóan javította az IGFBP-3 aktivitást. Ezen megállapítások alapján úgy véljük, hogy az XTTF főzet, amely bőséges táplálékot szolgáltat és hatékony összetevője az olyan anyagoknak, mint a poliszacharidok, valószínűleg gátolja a máj metasztázisát és gátolja a CRC folyamatát az IGF-1 és az IGF-1R lebontásával és az IGFBP szabályozásával. -3.

Összefoglalva, a vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy az elhízás stimulálhatja a tumor növekedését és a máj metasztázisát, növelheti az IGF-1 és az IGF-1R fehérje expresszióját és mRNS szintjét, és csökkentheti az IGFBP-3 szintet, mindezeket XTTF főzettel meg lehet fordítani. . Így az XTTF főzet jótékony hatással van a testi egészségre és hatékonyan gátolhatja a máj metasztázisát a CRC rákban, ami arra utal, hogy az XTTF főzet a CRC lehetséges kezelésére szolgálhat.

Nyilatkozat az ütköző érdekekről

A szerző (k) nem nyilatkoztak potenciális összeférhetetlenségről a cikk kutatásával, szerzőségével és/vagy publikációjával kapcsolatban.

Finanszírozás

A szerző (k) nyilvánosságra hozták a következő pénzügyi támogatás kézhezvételét a cikk kutatásához, szerzőségéhez és/vagy publikálásához: Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta „A Xiaotan Sanjie főzet szerepe és mechanizmusa a sejtmigrációról és invázió a gyomorrákban, a CAF-ek szaporodása és a kapcsolódó faktor expressziója alapján a tumor mikrokörnyezetében ”(81603524) és a Sanghaji Városi Egészségügyi Hivatal hagyományos kínai orvoslás tudományos kutatási alapjai„ Pinkang professzor által használt „A váladék diszpergálása és a stagnálás megszüntetése” főzet klinikai hatásai Wei közepes és előrehaladott gyomorrákban szenvedő betegeknél ”(2012L092B).