A Zicao acetilszikoninja megakadályozza a zsírok magas zsírtartalmú étrendben történő patkányok elhízását a lipidek felhalmozódásának gátlásával és a lipolízis kiváltásával.

Egyenletesen járult hozzá ehhez a munkához: Meiling Su, Wendong Huang

Csatlakozási osztály Farmakológiai, Szív- és agyi érrendszeri kutatóközpont, Zhongshan Orvostudományi Kar, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Egyenletesen járult hozzá ehhez a munkához: Meiling Su, Wendong Huang

Csatlakozási osztály Farmakológiai, Szív- és agyi érrendszeri kutatóközpont, Zhongshan Orvostudományi Kar, Sun Yat-sen Egyetem, Guangzhou, Kína

Meiling Su,
Wendong Huang,
Banghao Zhu

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Su M, Huang W, Zhu B (2016) A Zicao-tól kapott acetil-szikonin megakadályozza az elhízást a patkányokban magas zsírtartalmú étrenden a lipidek felhalmozódásának gátlásával és a lipolízis kiváltásával. PLoS ONE 11 (1): e0146884. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146884

Szerkesztő: Anna Alisi, Bambino Gesù Gyermekkórház, OLASZORSZÁG

Fogadott: 2015. június 24 .; Elfogadott: 2015. december 24 .; Közzétett: 2016. január 15

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a cikkben található.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt a Nemzeti Oktatási Minisztérium és Guangdong tartomány (2007B090400089 sz.) És (2007A032702001) közös projektje támogatta. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Különböző elhízás elleni gyógyszereket, köztük orlisztátot, lorcaserint és kiterjesztett felszabadulású fentermint/topiramátot és naltrexont/bupropiont hagyott jóvá az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala elhízott felnőttek krónikus súlykezelésére [9]. Bár klinikailag hatékonyak, ezeknek a gyógyszereknek vannak mellékhatásai, például gyomor-bélrendszeri megbetegedések, aszténia, mentális zavarok vagy kardiovaszkuláris hatások [10]. Ezért hatékony, de nem mérgező elhízás elleni gyógyszerre van szükség természetes forrásokból. Az acetil-szikonin (AS) és kivonata egyaránt a hagyományos kínai Zicao gyógyszerből származik, tisztasága 98,4%, illetve> 80%, amint azt nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás módszerrel kimutatták. A Zicao egy széles spektrumú vegyület, amely gyulladáscsökkentő, daganatellenes, antibakteriális, vírusellenes és sebgyógyító tulajdonságokkal rendelkezik [11, 12, 13, 14]. A Zicao-t és a shikonint egyaránt használták az elhízás kezelésére [15, 16, 17]; az utóbbit a zsír felhalmozódásának gátlására javasolták a 3T3-L1 adipocitákban [18].

A meglévő elhízás elleni gyógyszerek úgy működnek, hogy számos molekula megcélzásával indukálják az adipocita apoptózist, gátolják a lipidfelhalmozódást és stimulálják a lipolízist [19]. A peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor (PPAR) y és a CCAAT/fokozót megkötő fehérje (C/EBP) α kulcsfontosságú transzkripciós tényező az adipocita differenciálódás során [20]; kimutatták, hogy a shikonin expressziójának gátlásával megakadályozza a lipidfelhalmozódást [16, 18]. A lipidmetabolizáló enzimek, például a hormon-érzékeny lipáz (HSL) és a zsírszegény TG-lipáz (ATGL) a lipolízis legfontosabb szabályozói, amelyek az intracelluláris triacil-glicerin és a diacil-glicerin hidrolizálásával hatnak a NEFA és a glicerin felszabadítására. A HSL-foszforilációt a PKA jelátviteli kaszkád közvetíti, aktiválása fokozza a TG lipolízist az adipocitákban [22]. Az ATGL magas szubsztrát-specifitást mutat a triacil-glicerin és nagyon alacsony affinitást mutat a diacil-glicerin iránt a lipolízis során [23]. Ezért a HSL, az ATGL és a perilipin elengedhetetlenek a katekolamin-stimulált lipolízishez [24, 25]. Az azonban továbbra sem tisztázott, hogy az AS hasonló hatással van-e a lipid anyagcserére és ennélfogva az elhízásra. Jelen tanulmány ezzel a kérdéssel foglalkozott az AS elhízás elleni hatásának és a kapcsolódó mechanizmusok értékelésével a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás patkánymodelljében.

Eredmények

Az AS kivonat csökkenti a patkányokban a HFD által kiváltott elhízást

A patkányokat öt csoportba osztották: normál étrend (normál kontroll); HFD kezelés nélkül (HFD modell); és HFD AS kivonat kezeléssel 100, 300 és 900 mg/kg dózisban (alacsony, közepes és nagy dózisban). A HFD modellcsoport élelmiszer-hatékonysági arányát és testtömegét 30,6% -kal, illetve 49,3% -kal növelték a normál kontrollokhoz viszonyítva (P 0,05) (1A. Ábra); az élelmiszer-hatékonysági arány azonban alacsonyabb volt az AS-kivonattal kezelt patkányokban [10,0% ± 0,14% (alacsony dózis), 7,8% ± 0,18% (középső dózis) és 8,5% ± 0,23% (nagy dózis) szemben 12,8% ± 0,23 % (HFD modell); P 1. ábra. Az AS kivonat csökkenti a HFD által kiváltott elhízást patkányokban.

A patkányokat véletlenszerűen öt csoportba soroltuk: normál kontroll, HFD modell és HFD AS kivonattal (100, 300 vagy 900 mg/kg). Az extraktumot 6 hétig intragasztrikusan adagoltuk. (A) Patkányonkénti táplálékfelvételt hetente hatszor regisztráltak. (B) Az élelmiszer-hatékonysági hányadot a testtömeg-gyarapodás és a táplálékfelvétel hányadosaként számolták ki. (C) A testsúly változását hetente hatszor mértük. (D) Az adott héten mért testtömeg-növekedést levontuk az előző hét súlyából. Az értékeket átlag ± SE (n = 30) értékben fejezzük ki. Jelentős különbségeket figyeltünk meg a normál és a HFD csoportok között. * P # P ## P ### P 2. ábra. Az AS kivonat csökkenti a zsírszövet tömegét, a fehér zsírsejtek méretét és a máj felhalmozódását elhízott patkányokban.

Együtthatói (A) epididymális zsírszövet és (B) a májat a kísérlet végén 12 órás éhezés után számítottuk ki az alábbi egyenlet szerint: együttható = szövet (g/patkány)/tömeg (g/patkány). (C) Epididymális zsírszövet és (D) májat hematoxilinnel és eozinnal festettük kórszövettani vizsgálat céljából. A képeket 400-szoros nagyítással készítettük fénymikroszkóppal. Az értékeket átlag ± SE (n = 6) értékben fejezzük ki. Jelentős különbségeket figyeltünk meg a normál és a HFD csoportok között. * P # P ## P ### P 1. táblázat: Az acetil-szikonin hatása a szérum biokémiai paramétereire HFD-indukált elhízott patkányokban.

Az AS gátolja a differenciálódást és a zsír felhalmozódását a preadipocita sejtekben

A különböző koncentrációjú AS-ekkel 24 órán át inkubált 3T3-L1 sejtek életképességét a 3- (4, 5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-idifenil-tetrazolium-bromid (MTT) vizsgálattal értékeltük. 0,005 és 5 μM közötti koncentrációjú AS-sel végzett kezelésnek nincs hatása az életképességre (P> 0,05; n = 6) (3A. Ábra). A teljesen differenciált adipociták olajvörös O-val történő festésével kiderült, hogy az adipocita differenciálódás és a lipidfelhalmozódás dózisfüggő módon elnyomott AS jelenlétében (P 3. ábra. Az AS gátolja a 3T3-L1 preadipocyta differenciálódást és a zsír felhalmozódását.

(A) A sejtek életképességét az MT kezelés után 24 órával az AS kezelés után értékeltük. (B) Relatív lipidtartalom. (C) A zsírcseppek képződésének gátlása az AS által. A 3T3-L1 sejteket beoltottuk és 8 napos differenciálódásra indukáltuk AS-nal vagy anélkül 6-lyukú lemezeken, majd Oil Red O-val festettük és fénymikroszkóppal (200x) képalkotottuk. Az értékeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. Jelentős különbségeket figyeltünk meg a kezeletlen és a differenciált kontroll sejtek között. * P # P ## P ### P 4. ábra: AS gátolja a PPARγ, C/EBPα, HSL és ATGL expressziót adipocitákban.

A fehérjeszinteket Western blot alkalmazásával értékeltük 0, 2, 4 és 7 napig tenyésztett 3T3-L1 sejtekben 1,5 μM AS jelenlétében vagy hiányában adipogenezis során. Az immunblotok öt független kísérletet reprezentálnak; A β-aktin töltéskontrollként szolgált. * P 5. ábra. Az AS lipolízist indukál érett adipocitákban.

Az érett 3T3-L1 sejteket 24 órán át inkubáltuk különböző AS koncentrációkkal (0, 0,5, 1,5 és 4,5 μM). Az értékeket a lyukanként felszabaduló glicerin átlagos mennyiségében (± SE), a kontrollérték százalékában fejezzük ki. Minden kezeléshez négy ismétlést hajtottunk végre. Az eltérő betűvel jelölt eszközök jelentősen eltérnek egymástól (P 6. ábra. AS érett lipocitákban lipolízist indukál a PKA és a HSL foszforilációjának és aktivitásának aktiválásával.

A teljesen differenciált 3T3-L1 adipocitákat 3 órán át inkubáltuk különböző AS koncentrációk (0, 0,5, 1,5 és 4,5 μM) távollétében és jelenlétében. Az immunblotok hét független kísérletet reprezentálnak; A β-aktin töltéskontrollként szolgált. * A vér lipidszintjének 3-szoros növekedése, és véletlenszerűen a négy csoport egyikébe sorolták (n = 6 mindegyik): HFD modell (kezeletlen) és HFD alacsony (100 mg/kg), középső (300 mg/kg) kezeléssel ), vagy magas (900 mg/kg) dózisú AS. A normál kontroll patkányokat standard táplálékkal etették, míg a HFD 10% sertészsírt, 1,25% koleszterint, 0,5% epesót, 10% tojássárgája port és 78,75% standard étrendet tartalmazott. A vivőanyagot (desztillált víz) vagy az AS kivonatot intragasztrikusan adtuk 6 hétig HFD patkányoknak. A testtömeget és az ételbevitelt hetente hatszor regisztrálták.

Biokémiai elemzés

A kísérlet végén a patkányokat 12 órás böjt után érzéstelenítettük és felöltük. A vért a hasi vena cava-ból vettük, és 3000 fordulat/perc sebességgel 15 percig szobahőmérsékleten centrifugáltuk. A szérum triglicerid (TG), az összes koleszterin, a nagy sűrűségű lipoprotein (HDL) koleszterin, az alacsony sűrűségű lipoprotein (LDL) koleszterin és a szabad zsírsav (FFA) szintjét 7180-as modell automatizált biokémiai analizátorral (Hitachi, Tokió, Japán) mértük.

Szövettani elemzés

A fehér zsírszövetet (epididymist) és a májat kivágták a patkányoktól, majd azonnal lemérték és 10% -os formalinos oldatban rögzítették 1 napig. Az etanolban végzett dehidratálás után a szövetet paraffinba ágyazták és 5 μm vastagságú szakaszokra vágták, amelyeket hematoxilinnel és eozinnal festettek. A metszeteket IX71 invertált fénymikroszkópon (Olympus, Tokió, Japán) 200x-os nagyítással készítettük.

Sejtkultúra és differenciálás

Az egér fibroblaszt 3T3-L1 preadipocitákat az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA, USA) szereztük be, és 10% borjúszérumot, penicillint (100 U/ml) és sztreptomicint (100 μg/ml) tartalmazó magas glükózszintű DMEM-ben tenyésztettük. 5% CO2 atmoszférában és 37 ° C-on. A táptalajt hetente háromszor cserélték. A sejteket 6 üregű lemezeken összefolyásig növesztettük, és a differenciálódást 0,5 mM IBMX, 0,5 mM DEX és 10 mg/l inzulint tartalmazó adipogén koktél hozzáadásával magas glükózszintű DMEM-ben, 10% magzati marhaszérumban (FBS) 2 napok. A táptalajt ezután további 2 napig 10% FBS-sel és 10 mg/l inzulinnal ellátott DMEM-mel helyettesítettük, majd a táptalajt 2 naponta 10% FBS-t tartalmazó DMEM-mel helyettesítettük, amíg a tenyésztett preadipocyták körülbelül 95% -a érett adipocitákká nem differenciálódott. Az AS adipocita differenciálódásra gyakorolt hatásának értékeléséhez az összefolyó 3T3-L1 preadipocitákat 0, 0,5, 1,5 vagy 4,5 μM AS-el kezeltük adipogén koktél jelenlétében 7 napig.

A sejtek életképességének vizsgálata

A 3T3-L1 sejtek életképességét az MTT assay-vel értékeltük, a korábban leírtak szerint [22]. A sejteket 96 lyukú lemezeken növesztettük 2 × 104 sejt/üreg sűrűséggel. Az éjszakai tapadás után a sejteket AS-sel stimuláltuk különböző koncentrációkban (0,005, 0,05, 0,5 vagy 5 DMSO-ban). A kontrollcsoportot DMEM-mel kezeltük 10% FBS-sel és 0,1% DMSO-val. 24 órán át 37 ° C-on 5% CO2-ban végzett inkubálás után a sejteket háromszor mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). MTT reagenst (10 μl 1 mg/ml oldat) és táptalajt (100 μl) adtunk minden egyes lyukba, majd sötétben inkubáltuk 37 ° C-on 4 órán át. A formazan kristályokat DMSO-val oldjuk, és az abszorbanciát 570 nm-nél Elx-800 mikrolemez-olvasón mértük (BioTek, Winooski, VT, USA).

Olajvörös O festés és sejtszám

Olajvörös O festést egy korábban leírt módszer szerint hajtottunk végre [44]. A 3T3-L1 sejteket a fent leírt módon differenciálódásra indukáltuk, háromszor PBS-sel mostuk, 10% formalinnal rögzítettük 1 órán át, majd Oil Red O-val (0,5% 60% izopropanolban) festettük 30 percig. Az adipocitákat 70% -os etanollal mossuk vízben, majd levegőn szárítjuk. A festett sejteket fénymikroszkóppal tettük láthatóvá, és 200x-os nagyítással képeket készítettünk. Olajvörös O-festett lipideket 100% izopropanollal oldottunk, és az abszorbanciát 490 nm-en spektrofotométerrel határoztuk meg.

Lipolízisvizsgálat

A teljesen differenciálódott adipocitákat (azaz a 8. napot) egy éjszakán át szérumhiányban szenvedtük 2% szarvasmarha-szérum albumint tartalmazó fenolvörös-mentes táptalajban, és AS-val (0, 0,5, 1,5 vagy 4,5 μM) kezeltük, vagy 24 órán keresztül kezeletlenül hagytuk. A kísérlet végén 100 μl táptalajt vettünk ki minden üregből, és egy 96 üreges lemezre vittük át a glicerin szintjének meghatározása céljából. A vizsgálati készlet reagensét minden üregbe hozzáadtuk, és 37 ° C-on 10 percig inkubáltuk, majd az 570 nm-en mért abszorbanciát mikrolemez-olvasóval leolvastuk.

Western Blot elemzés

A sejtekből származó összes fehérjét proteáz és/vagy foszfatáz inhibitor koktélt tartalmazó lízispufferrel extraháltuk. A fehérjekoncentrációt bicinchonininsav-készlettel határoztuk meg. A fehérjéket 8% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid-gélelektroforézissel elválasztottuk, majd polivinilidén-difluorid membránra (Millipore, Billerica, MA, USA) vittük át, amelyet 5% zsírmentes száraz tejjel blokkoltunk Tris-pufferolt sóoldatban, Tween 20-tal ( TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) 1 órán át. A membránt ezután egy éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk a következő fehérjék elleni elsődleges antitestekkel: PPARy, C/EBPa és HSL (1: 1000); ATGL, foszfo-HSL (Ser563) és foszfo-PKA (1: 1000). Miután háromszor mostuk TBST-vel, a membránokat HRP-konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel (1: 1000) inkubáltuk 1,5 órán át. P-aktin antitestet (1: 3000; Sejtjelzési technológia) használtunk terhelés kontrollként. A fehérjéket fokozott kemilumineszcenciával detektáltuk (Beyotime, Sanghaj, Kína).