Alacsony kalóriatartalmú cukor és funkcionális jujube ételek kifejlesztése biológiai transzformációs és fermentációs kapcsolási technológiával

Nemzeti mérnöki laboratórium ipari enzimekhez, Tianjin Ipari Biotechnológiai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Tianjin, Kína

Levelezés

Jiangang Yang, ipari enzimek nemzeti mérnöki laboratóriuma, Tianjin Ipari Biotechnológiai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Tianjin, Kína.

Nemzeti mérnöki laboratórium ipari enzimekhez, Tianjin Ipari Biotechnológiai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Tianjin, Kína

Levelezés

Jiangang Yang, ipari enzimek nemzeti mérnöki laboratóriuma, Tianjin Ipari Biotechnológiai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Tianjin, Kína.

Nemzeti mérnöki laboratórium ipari enzimekhez, Tianjin Ipari Biotechnológiai Intézet, Kínai Tudományos Akadémia, Tianjin, Kína

Absztrakt

1. BEMUTATKOZÁS

Jujube (Ziziphus jujuba Mill), egy tövises ráncos növény, általában kínai jujube vagy vörös datolya néven ismert. A jujube gyümölcs sok tápanyagot tartalmaz, például poliszacharidot, triterpenoidot, flavonoidokat, vitaminokat, ciklikus nukleotidokat és fenolos vegyületeket (Du et al., 2013; Lee, Min, Lee, Kim, & Kho, 2003; Li, Fan, Ding, És Ding, 2007). Különösen a jujube gyümölcsök tartalmaznak bizonyos mennyiségű ciklikus adenozin-monofoszfátot (cAMP), amely pozitív hatással van a szívizomra, a táplálkozási szívizomra, a diasztolés erekre, az antiaritmiára és a trombocitaellenes aggregációra (Beavo & Brunton, 2002). A funkcionális élelmiszerek fejlesztése, mivel gazdag a CAMP, nagy gazdasági potenciállal és piaci értékkel bír. A Jujube-t évezredek óta hagyományos kínai orvoslásként (TCM) is használják, számos egészséget elősegítő hatásával, mint például gyulladáscsökkentő (Yu et al., 2012), rákellenes (Plastina et al., 2012), emésztőrendszeri védő hatású. (Huang, Yen, Sheu és Chau, 2008), antioxidáns (Cheng, Zhu, Cao és Jiang, 2012), álmatlanság elleni és neuroprotektív hatások (Yoo et al., 2010).

A tejsavbaktériumok fermentációs technológiája bizonyítottan hatékony módszer a gyümölcsök és zöldségek ízének, biztonságának, táplálkozásának, minőségének és eltarthatóságának fenntartására vagy javítására. Az erjesztett élelmiszerek tápértéke az erjedési folyamat során a szabad aminosavak (FAA) felhalmozódása révén nőtt. Egyes tejsavbaktériumok általában γ-amino-vajsavat (GABA) termelnek, amelynek neurotranszmissziós, hipotenziós, diuretikus és nyugtató hatásai vannak (Wong, Bottiglieri és Snead, 2003). A GABA-val dúsított italok fermentációs módszerrel történő fejlesztése sikeres volt a fekete málna lében (Kim, Lee, Ji, Lee és Hwang, 2009), a tejben (Nejati et al., 2013) és a tempeh-szerű italokban (Aoki, Furuya, Endo és Fujimoto, 2003). Ezenkívül a tejsavbaktériumokat mint probiotikumokat egyre inkább táplálékkiegészítőként használják. A probiotikus termékeket általában fermentált tejtermékek, gyümölcs- vagy zöldséglevek (sárgarépalé, paradicsomlé) formájában forgalmazzák, amelyek a sejtek növekedésének közegeként szolgálnak.

Ebben a tanulmányban megkíséreljük növelni a koncentrált/kivont jujube juice tápértékét az enzimtranszformáció és a tejsavbaktériumok fermentációjának összekapcsolásával. Összehasonlítottuk a különböző típusú jujube glükóz- és fruktóztartalmát. Két enzimet, a GI-t és a DAE-t kombináltuk, hogy a glükóz és a fruktóz alacsony kalóriatartalmú, édesebb D-allulózzá alakuljon. Ezenkívül a jujube juice fermentálását kétféle tejsavbaktérium alkalmazásával végeztük a GABA és sok szabad aminosav tartalmának növelése érdekében.

2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

2.1 Enzimek, törzsek és anyagok

A D-allulóz-3-epimerázt (DAE) az extracelluláris termelésnek megfelelően állítottuk elő titkos expressziós rendszeren keresztül (Chen et al., 2016). A D-glükóz izomerázt (GI) a kínai Novozymes ®, Ltd. cégtől vásárolták. A DAE aktivitása elérte a 31,0 U/ml-t, a GI pedig 400 IGIU/g volt. Tejsavbaktériumok, mint pl Pediococcus pentosaceus PC-5, Lactobacillus plantarum M, Lactobacillus rhamnosus, és Lactobacillus acidophilus, laboratóriumunkban tárolták. Az ebben a cikkben használt ötféle jujube gyümölcsöt gyűjtöttünk 2016. szeptember és október között a kínai Shanxi tartomány Taiyuan városában.

2.2 A cukortartalom elemzése öt jujube gyümölcsben

Ziziphus jujuba általában jujube vagy kínai dátumnak hívják. Ebben a tanulmányban öt fajtából (Changhong, J-CH; Dongzao, J-DZ; Jinsi, J-JS; Pozao, J-PZ; és Yuanling, J-YL) származó jujube gyümölcsöket gyűjtöttek ősszel. Az összes jujube-mintát felszeleteltük, vízben 3 órán át forraltuk, majd a maradékot eltávolítottuk, és így tömény levet kaptunk. A glükóz, fruktóz és szacharóz tartalmát nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) elemeztük, amely törésmutató-detektorral és egy Sugar-Pak ™ oszloppal (6,5 mm × 300 mm; Waters) volt felszerelve. Az összes poliszacharidot fenol-kénsav kolorimetriás módszerrel határoztuk meg (Cheung et al., 2009). A redukáló cukrot DNS módszerrel detektáltuk (Cheung et al., 2009).

2.3 A monoszacharid enzimatikus átalakulása a jujube juice-ban

A GI és a DAE által katalizált enzimatikus átalakulást 55 ° C-on tömény jujube juice-ban hajtottuk végre, amelynek pH-ját 1 M NaHC03-tal 6,0-ra állítottuk be. 4 órán át tartó reakció után a mintákat HPLC-vel elemeztük a D-allulóz koncentrációjának kiszámításához. Vizsgálták a hőmérséklet (50–65 ° C), a pH (4,0–8,0) és az enzimmennyiség (0,5–2,0 g/l) hatását a D ‑ allulóz konverziójára.

2.4 A jujube juice erjesztése tejsavbaktériumokkal

Pediococcus pentosaceus PC-5 és L. plantarum M-t választottunk sejtnövekedésük, savtermelésük, valamint az összes polifenol és az összes flavonoid tartalmának értékelésére. A kiválasztott kiindulási anyagokat MRS táptalajon, 37 ° C-on 24 órán keresztül előtenyésztettük, amíg kb

10 9 c.f.u/ml. Ezután a sejteket koncentrált jujube juice-ba oltottuk be hatszoros hígítással 500 ml-es lombikokban. A fermentációs folyamatot ezután 24 órán át 37 ° C-on hajtjuk végre. Mintákat gyűjtöttünk HPLC és sejtnövekedési elemzés céljából. Az életképes sejteket (c.f.u/ml) standard lemezszámlálási módszerrel határoztuk meg.

2.5 Táplálkozási összetevők elemzése

A szerves savak (tejsav és ecetsav) koncentrációit HPLC-vel számszerűsítettük Aminex HPX-87H oszlopon (ionkizárás, BioRad), 210 nm-en működő UV detektorral. 10 mM H2SO4 oldat mozgófázisát alkalmaztuk 0,6 ml/perc áramlási sebességgel, és az oszlopot 60 ° C-on működtettük.

Az FAA-kat és a γ-amino-vajsavat (GABA) HPLC-vel határoztuk meg ZORBA Eclipse-AAA (4,6 mm × 150 mm; Agilent) alkalmazásával, UV-detektorral 338 nm-en. A mozgófázisok A (egyensúlyi fázis): nátrium-dihidrogén-foszfát (40 mM) és B (elúciós fázis): acetonitril: metanol: víz (45:45:10). Borát puffert használtunk származék reagensként. Az áramlási sebesség 2 ml/perc volt 40 ° C-on.

A cAMP koncentrációját szintén HPLC-vel mértük egy fordított fázisú Ultimate C18 oszlop (21,2 mm × 250 mm, 5 μm részecskék, Welch, Shanghai, Kína) felhasználásával, UV-detektorral 254 nm-en. Kálium-dihidrogén-foszfát (20 mM): metanol = 80:20 oldat mozgófázisát használtuk 0,8 ml/perc sebességgel, és az oszlopot 40 ° C-on működtettük.

A fémionokat atomabszorpciós spektrofotométerrel (Spectra-AA220, Varian Co., Palo Alto, Kalifornia, USA) határoztuk meg kevert savakban (salétromsav: perklórsav = 4: 1) történő emésztést követően. A foszfortartalmat molibdén-kék módszerrel határoztuk meg 660 nm hullámhosszon (Wei, Chen és Xu, 2009).

A jujube juice teljes fenoltartalmát a Folin – Ciocalteu kolorimetriás módszerrel határoztuk meg (Tawaha, Alali, Gharaibeh, Mohammad és El-Elimat, 2007). 0,2 ml mintát szobahőmérsékleten 3 percig 0,2 ml Folin – Ciocalteu reagenssel keverünk. Ezután 0,4 ml 10% -os Na2CO3-ot adunk az elegyhez. 60 perc állás után az abszorbanciát spektrofotométerrel mértük 725 nm-en.

Az összes flavonoid tartalmát NaNO2 – AlCl3 – NaOH módszerrel mértük (Fu, Xu, Zhao és Ma, 2006). Röviden: 30 μl metanolban hígított mintát (1: 2) összekevertünk 9 μl NaNO2-val (5%). 6 percig tartó reakció után 18 μl AlCl3-ot (10%) adunk hozzá. További 5 percig tartó reakció közben 60 μl NaOH-ot (1 M) adunk az elegyhez. Az elegy térfogatát desztillált vízzel 300 μl-re állítottuk be, majd 510 nm-en mértük. Különböző rutin koncentrációkat (0,1–500 mg/l) használtunk a standard görbe kiszámításához.

3. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

3.1. A cukortartalom elemzése

Ismert volt, hogy a jujube nagy koncentrációban tartalmaz cukrot; a cukortartalom azonban nyilvánvalóan különbözik a fajták között (Li et al., 2007). Itt összehasonlítottuk az összes cukor, szacharóz és redukáló cukor mennyiségét öt különböző fajta (J ‐ CH, J ‐ DZ, J ‐ JS, J ‐ PZ, J ‐ YL) jujube juice-ban, amelyeket Kínában széles körben terjesztenek. . A szacharóztartalom öt fajtában:

3.2. D-allulóz biokonverziója koncentrált jujube juice-ban

A J ‐ JS jujube juice nagy mennyiségű glükózt és fruktózt tartalmazott, amelyek mind magas kalóriatartalmú cukrot tartalmaznak. A J ‐ JS jujube juice közvetlen bevitele élelmiszer-italokba növelné az elhízás, a cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek kockázatát (Bocarsly, Powell, Avena és Hoebel, 2010; Goran, Ulijaszek és Ventura, 2013; Stanhope et al., 2015 ). Az enzimatikus transzformációs stratégia a glükóz izomeráz (GI) alkalmazásával, amely katalizálta a glükóz fruktózzá történő izomerizációját, és a D-allulóz 3-epimeráz (DAE), amely a fruktóz epimerizációját D-allulózzá katalizálta, a glükóz és fruktóz magas fruktóz tartalmú kukoricaszirupban (HFCS) D-allulózzá, és növelte annak tápértékét (Men és mtsai, 2014). Itt egyfajta, „egészséges cukrot” tartalmazó jujube juice előállításához megkíséreltük a GI és a DAE kombinálását a koncentrált jujube juice-ban lévő glükóz és fruktóz D-allulózzá alakítására. A D-glükóz és a D-fruktóz koncentrációja a koncentrált jujube-ban 350, illetve 360 g/l volt (1. táblázat).

Tesztelem Kezdeti állapot Enzimatikus átalakítás Fermentáció

Glükóz (g/l)	352,16 ± 10,23	305 ± 8,26	295 ± 6,32
Fruktóz (g/l)	360,12 ± 5,32	295 ± 3,19	293 ± 5,69
Allulóz (g/l)	n.f.	110 ± 2,10	110 ± 3,09
Tejsav (g/L)	n.f.	n.f.	3,2 ± 0,20
Életképes sejtek (c.f.u/ml)	n.f.	n.f.	10 8.47
pH	4.13	6.23	4.02
GABA (mg/l)	0	0	100 ± 0,98
cAMP (mg/l)	114 ± 2,67	116 ± 1,87	116 ± 1,58
Összes fenol (mg/l)	22,25 ± 0,21	21,01 ± 0,13	16,13 ± 0,32
Összes flavonoid (mg/l)	146,67 ± 0,34	135,56 ± 0,15	120,12 ± 0,49

Leggyakrabban a ritka cukrok kereskedelmi előállítását savas körülmények között lehet a legjobban végrehajtani. A jujube juice pH-ja 3,6–3,8 volt. Ebben a feltételben a GI és a DAE egyaránt inaktiválódott (Men és mtsai., 2014; Zhu és mtsai., 2012). Ezután 1 M NaOH-val állítottuk be a pH-t 4,0 és 8,0 között. Meghatároztuk az enzimatikus átalakulást ilyen körülmények között. A 2a. Ábra eredményei azt mutatták, hogy a D-allulóz termelés a pH-érték javulásával együtt növekedett (2a. Ábra). Amikor a pH-t 6,5–8,0-ra állítottuk, a jujube juice-ban a teljes monoszacharid (glükóz, fruktóz és D-allulóz) D-allulóz-tartalma 15,2% -ot ért el, ami az elméleti értéket képviselte (Men et al., 2014).

A hőmérsékletnek a D-allulóz termelésére gyakorolt hatását a reakcióhőmérséklet 50-60 ° C-os szabályozásával is optimalizáltuk. 50 ° C-on tartva a 8 órás reakció után a D-allulóz tartalma 15% -ra emelkedett; ez az érték azonban 60 ° C alatt 11,5% -ra csökken (2b. ábra). Ennek oka valószínűleg a DAE enzimaktivitásának csökkenése volt magas hőmérsékleten (Zhu és mtsai, 2012). Általánosan ismert, hogy megemelt üzemi hőmérsékletre van szükség a ritka cukrok ipari előállításához, mert a magas reakcióhőmérséklet nagyobb reakcióképességet, alacsonyabb viszkozitást, nagyobb stabilitást, magasabb eljárási hozamot és kevesebb szennyeződést vált ki (Mozhaev, 1993). Mindazonáltal a 70 ° C feletti hőmérsékleten történő működés felgyorsítja az enzimatikus barnulási reakciót és a melléktermékek képződését, és tönkreteszi a gyümölcslé tápanyagát is.

Az enzimmennyiség kiegészítését ebben a reakcióban tovább optimalizáltuk. Megállapítottuk, hogy a D ‐ allulóz szintézise a reakcióegyensúlyig (15,2% -os tartalom) 8 órán belül ért el, amikor a DAE és a GI enzimmennyiségét egyaránt 1,0 g/l-re osztották. Az enzim mennyiségének megduplázása 2,0 g/l-rel 4 órára csökkentette a reakcióidőt. Amikor az enzim mennyisége 0,5 g/l-re vagy annál kevesebbre csökkent, hosszabb reakcióidőre volt szükség (2c. Ábra).

3.3 D-allulózt tartalmazó jujube-lé tejsavbaktériumos fermentációja

3.4 A tápanyag-összetevő elemzése fermentáció után

Figyelemre méltó, hogy az ásványi anyagok fontosak az emberi táplálkozás szempontjából (Ekmekcioglu, 2000). Ezután megmértük az ásványi anyagot jujube juice-ban az erjedés előtt és után. Az eredmények azt mutatták, hogy a kálium (K +) tartalom 6 388,64 ± 62,31 mg/kg volt, ami a jujube juice-ban uralkodó ásványi anyag volt. A magnézium (Mg 2+) tartalma 442,86 mg/kg volt. Számos enzimre volt szükség, különösen az ATP-függő foszforilációs reakciókat katalizáló kináz-családokra (Li et al., 2007). A kalciumot (Ca 2+), amely biológiai aktivitást mutat a vérnyomás csökkentésében (Zemel, 1997), a jujube juice-ban is kimutatták. 24 órás erjesztés után a vas (Fe 2+) és a cink (Zn 2+) tartalma 34% -kal, illetve 20,7% -kal nőtt a kiindulási állapothoz képest. A szemszövetben, különösen a retinában és a choroidban nagy koncentrációban jelen lévő Zn 2+ fémion számos biológiai aktivitást mutatott a szem számára, amelyekről úgy gondolták, hogy kölcsönhatásba lépnek a taurinnal és az A-vitaminnal, módosítják a fotoreceptor plazma membránokat, szabályozzák a fény-rodopsin reakciót, modulálják szinaptikus átvitel, és antioxidánsként szolgál. (Bruce, Grahn, Phyllis, Katherine és Zhen, 2015). A Fe 2+ tartalom növekedése javítaná a jujube juice vértónus funkcióját (Marcel et al., 1999). Más ásványi anyagok szinte változatlanok voltak (2. táblázat).

Tesztelem Egység Kezdeti állapot Fermentálás

Fe	mg/kg	2,93 ± 0,11	3,93 ± 0,23
Mg	mg/kg	442,86 ± 7,17	448,90 ± 6,34
Mn	mg/kg	1,49 ± 0,11	1,77 ± 0,09
Ca	mg/kg	82,20 ± 0,57	86,74 ± 0,69
Zn	mg/kg	5,3 ± 0,31	6,4 ± 0,42
K	mg/kg	6 388,64 ± 62,31	6,414,68 ± 83,26
P	mg/100 g	60 ± 1,25	69,9 ± 0,97

Ezután megvizsgáltuk a fermentáció hatását a szabad aminosavak (FAA) komponensének változására a jujube juice-ban. 24 órás fermentáció után az FAA komponens nyilvánvalóan különbözött a kezdeti állapottól. Jellemzően Asp, Glu, Ser, Gly, Thr, Ala, Val, Ile és Leu tartalma különböző szinten nőtt (5. ábra). Az elágazó láncú aminosavak (BCAA), például a Val, az Ile és a Leu szükségesek az emberi egészség szempontjából. A BCAA-ban gazdag étrend kiegészítése pozitív hatással volt a testtömeg, az izomfehérje-szintézis és a glükóz homeosztázis szabályozására, és ezek fontos és hatékony táplálék-kiegészítők a sport számára. (Lynch & Adams, 2014). Különösen az Asp védő hatást gyakorol a szívizomra. Csökkenti a nitrogén és a szén-dioxid mennyiségét a vérben, fokozza a máj működését és megszünteti a fáradtságot (Thomas és mtsai, 2003). A FAA-k előállítása valószínűleg a fehérjék vagy kis peptidek bomlásából származott, amelyet a tejsavbaktériumok glükóz fermentációja során szintetizáltak, és a test könnyebben felszívta az italokban.

4 KÖVETKEZTETÉS

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezt a munkát a Kínai Nemzeti Kulcsfontosságú Kutatási és Fejlesztési Program (2017YFD0400705‐3) támogatta; Jiangxi tartomány nemzeti kulcsfontosságú kutatási és fejlesztési programja (20171ACH80014). A Kínai Tudományos Akadémia Ifjúsági Innovációs Promóciós Egyesülete (2016163).

ÉRDEKLŐDÉSEK

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

ETIKAI ÁTTEKINTÉS

Ez a vizsgálat nem von maga után ember- vagy állatkísérleteket.