Az A-vitamin fokozott étrendi bevitele elősegíti az aorta szelep meszesedését in vivo

A szív- és érrendszeri és tüdőkutatási központból, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); A Szívközpont, Országos Gyermekkórház, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); Molekuláris és sejtes farmakológiai diplomás program, Leonard M. Miller Orvostudományi Kar, Miami, FL (D.J.H.); Biomedical Science Graduate School, Biomaterials and Bioengineering Institute, Tokyo Medical and Dental University, Tokió, Japán (H.K.); és az Ohio Állami Egyetem Gyermekgyógyászati Tanszéke, Columbus, OH. (J. L.).

A szív- és érrendszeri és tüdőkutatási központból, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); A Szívközpont, Országos Gyermekkórház, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); Molekuláris és sejtes farmakológiai diplomás program, Leonard M. Miller Orvostudományi Kar, Miami, FL (D.J.H.); Biomedical Science Graduate School, Biomaterials and Bioengineering Institute, Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem, Tokió, Japán (H.K.); és az Ohio Állami Egyetem Gyermekgyógyászati Tanszéke, Columbus, OH. (J. L.).

Ön a cikk legfrissebb verzióját nézi. Előző verziók:

Absztrakt

Célkitűzés-

A kalcifikus aortabillentyű betegség (CAVD) jelentős közegészségügyi probléma, a műtéten kívül más hatékony kezelés nem áll rendelkezésre. Korábban kimutattuk, hogy az érett szívbillentyűk kalcifikálódnak a retinsav (RA) kezelésre adott válaszként az SRY transzkripciós faktor csökkentése révén Sox9. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk az A-vitamin és metabolitja feleslegének a szívszelep szerkezetére és működésére gyakorolt hatásait in vivo, és megvizsgáltuk az RA jelátvitel molekuláris mechanizmusait in vitro a meszesedési folyamat során.

Módszerek és eredmények—

Megközelítések kombinációjával meghatároztuk a meszes aorta szelep betegség patogenezisét egerekben, akiket 200 NE/g és 20 NE/g retinil-palmitáttal tápláltak 12 hónapig molekuláris, sejtes és funkcionális szinten. Megmutattuk, hogy az A-vitamin felesleggel táplált egereknél az aorta szelep szűkülete és a betegtájékoztató meszesedése alakul ki, ami az osteogén gének fokozott expressziójával és a porcos markerek csökkent expressziójával jár. Farmakológiai megközelítést alkalmazva megmutatjuk, hogy az RA mediált Sox9 az elnyomást és a meszesedést a klasszikus RA jelátvitel szabályozza, és mind RA, mind retinoid X receptorokat igényel.

Következtetés-

Vizsgálataink azt mutatják, hogy az A-vitamin túlzott mennyiségű étrend-bevitele elősegíti a szívbillentyűk meszesedését in vivo. Ezért arra utal, hogy az A hipervitaminosis a kalcifikus aorta szelep betegség új kockázati tényezőjeként szolgálhat az emberi populációban.

Bevezetés

A retinsav (RA) az A-vitamin (retinol) aktív metabolitja, amelyet étrendi forrásokból juttatnak a szervezetbe jórészt karotinoidok formájában. 16 A keringésben és a célszövetekben az aktív retinoidok jelzőmolekulaként működnek, hogy meghatározzák a sejtek azonosságát és a gén expresszióját. 17 RA specifikus nukleáris receptorokon keresztül, beleértve az RA receptor (RAR) és a retinoid X receptor (RXR) családokat, amelyek mindegyike 3 izoformából áll: α (a), β (b) és γ (g). Az ezen receptorokon keresztüli jelzés számos kulcsfontosságú sejtfolyamatban vesz részt, ideértve a sejtek differenciálódását, a sejtciklus-szabályozást, a sejtnövekedést és a sérülésre adott sejtreakciókat, és szerepet játszik az elhízás, a diabetes mellitus és a szív- és érrendszeri betegségek patogenezisében. A retinoidok legalapvetőbb hatásmechanizmusa az RA-ra reagáló magreceptorok transzkripciós szabályozása, amely a dimerek képződésétől függ. Az RXR homodimerként jelezhet, vagy heterodimer partnerként működhet más nukleáris receptorok, például RAR vagy D-vitamin receptorok esetében. Ezek a komplexek ezután specifikus válaszelemekhez kötődnek, beleértve az RA válaszelemeket, amelyek a célgének fokozó régióiban találhatók a pozitív és negatív funkció modulálása céljából. 18.

Anyagok és metódusok

Vad típus C57BL/6J az egereket vagy 20 NE/g retinolt tartalmazó retinil-palmitáttal (Harlan, TD.93160) vagy 200 NE/g retinil-palmitátot tartalmazó módosított A-vitamin-feleslegben (Harlan, TD.110146) 12 órán át tápláltuk. hónapig, és a leírás szerint echokardiográfiának vetik alá. 40 Funkcionális elemzés után az RNS-t aorta szelepekből vagy az egész szívből extraháltuk, és a kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióhoz előállított cDNS-t a leírás szerint készítettük. Alternatív megoldásként az egész szíveket rögzítettük és metszettük szövettani festés céljából a leírás szerint. 40 In vitro vizsgálatokhoz postnatalis egér vagy embrionális nap (E) 10 csirke mitralis és aorta szelepes explantátumokat ATRA-val (Sigma, 1 µmol/L), 9-cisz-RA-val (Enzo, 1 µmol/L), LE540 ( 100 µmol/l), PA452 (100 µmol/l), AM580 (Tocris Bioscience, 1 µmol/l), adapalén (Tocris Bioscience, 10 µmol/l) vagy dimetil-szulfoxid (DMSO; 0,001% végkoncentráció) 48 órán át . Az explantátumokat ezután üveglemezekre szereltük és rögzítettük a szövettani festéshez, vagy az RNS-t extraháltuk mikroarray elemzéshez Affymetrix Mouse GeneST Array segítségével. Az anyagok és módszerek teljes leírását a csak online elérhető adatmelléklet tartalmazza.

Eredmények

Hosszú távú felesleges étrendi A-vitamin elősegíti az aortaszelep szűkületét és a meszesedést

Az RA által közvetített meszesedés mind a RAR, mind az RXR aktivitását megköveteli

Egerekben végzett in vivo vizsgálatok eredményei (1. ábra) és korábban publikált in vitro munkánk 37 alátámasztják azt a hipotézist, hogy a fokozott RA jelátvitel elősegíti a szívbillentyűk meszesedését. Ennek további körvonalazása és az ehhez a folyamathoz szükséges molekuláris mechanizmusok meghatározása érdekében a RAR és RXR izoformák hozzávetőleges abszolút transzkriptumszámát vizsgálták postnatalis egér aorta- és mitrális szelepekben, valamint összehasonlítható stádiumokat a csirkében (embrionális [E] 10. nap ) (2. ábra). Egérszelepekben összehasonlítható RA receptor izoformák szintjét azonosítják a mitrális és aorta szelepekben, a RARα (RARa) a legjobban kifejeződik (2A. ábra). Ellentétben, RARb és RARγ (RARg) leginkább a csirkeszelepekben dominálnak (2B. ábra). Mivel RXRa és RXRb izoformákat nem jelentettek a madárrendszerben, ezeket nem vették fel az elemzésbe.

2. ábra. A retinsavreceptor izoformák nagymértékben expresszálódnak az egér és a csirke aorta- és mitrális szelepekben. Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció a különböző RAR és retinoid X receptor (RXR) izoformák hozzávetőleges abszolút transzkriptumszámának kimutatására postnatalis egerekben (A) és az embrionális 10. napi csirke (B) aorta (AoV) és mitrális (MV) szelepek.

Annak megállapítására, hogy az RA funkcionál-e a klasszikus RA receptor jelzésen keresztül a meszesedés elősegítése érdekében, a madár-, egér-aorta- és mitralis szelep-explantátumokat különféle farmakológiai RAR- és RXR-agonistákkal és antagonistákkal kezeltük (3A. Ábra). Mérsékelt koncentrációknál kimutatták, hogy az ATRA egy választható agonista a RAR-okra, míg a 9-cisz mind a RAR-okat, mind az RXR-eket aktiválja (3A. Ábra). Ami az antagonistákat illeti, az LE540 mint bevett pán-antagonista a RAR-ok számára, és a PA452 ismerten gátolja az RXR funkciót (3A. Ábra). 47 Az agonista és antagonista RAR és RXR aktivitás hatékonyságának meghatározásához kvantitatív polimeráz láncreakcióval határoztuk meg az RAR/RXR által közvetített RA célgén mRNS szintjét, RARb. 45 A várakozásoknak megfelelően az ATRA és a 9-cisz jelentősen megnő RARb expresszió a vivőanyag-kontrollokon (3B. ábra). Az antagonisták relatív gátlási szintjének vizsgálatához ebben a rendszerben az agonista aktivitást 100% -ra állítottuk be. Ezt a megközelítést alkalmazva megfigyelhetjük, hogy az LE540 kezelés 32,95 ± 4,93% -ra és 9,2 cis-mediált RAR aktivitást gátolja (3C. Ábra). A PA452 esetében az együttes kezelés 53,32 ± 9,27% -ra csökkenti az RXR aktivitást, míg az LE540 és a PA452 kezelés egyaránt 5,11 ± 0,05% -ra gátolja az aktivitást (3D ábra). Ezek a vizsgálatok megerősítik a RAR és az RXR tervezett farmakológiai aktiválását és gátlását.

3. ábra. Az all-transz retinsav (ATRA) által közvetített szívszelep meszesedéshez retinsav receptor (RAR) és retinoid X receptor (RXR) aktivitásra van szükség. A cE10 mitralis szelep explantátumokat 48 órán keresztül kezeltük jelzett agonistákkal, 4 órás antagonista előkezeléssel vagy anélkül. A, A RAR és RXR agonisták és antagonisták szelektivitását ábrázoló ábra. B és C, Kvantitatív polimeráz láncreakció a RARb kifejezés (B, C) az agonista kezelések során történő változásként (B), és százalékos változásként RAR (LE540) vagy RXR (PA452) pán-antagonistákkal történő előkezelés után, összehasonlítva az önmagában ATRA és 9-cisz agonistákkal. D, Kvantitatív polimeráz láncreakció-analízis a Sox9 expresszió önmagában agonista kezelésben és antagonistákkal történő előkezelés. *P

Ahogy korábbi tanulmányaink kimutatták, hogy az ATRA kezelés elősegíti a meszesedést a Sox9 37., a következő változásokat vizsgáltuk Sox9 expresszió az agonista és antagonista kezelésekre adott válaszként. Amint azt a 3D-s ábra mutatja, mind az ATRA, mind a 9-cisz jelentősen elnyomja Sox9 expresszió madár E10 aorta szelepes explantánsokban, és ez az elnyomás a LE540-gyel történő együttes kezeléssel enyhül a vivőanyag-kontrollokkal összehasonlítható szintig. A 9-ciszhez hasonlóan az LE540 vagy a PA452 kezelések is szignifikánsan megakadályozzák a 9-cisz közvetítését Sox9 elnyomás, bár mindkét antagonistával végzett kezelés a leghatékonyabb (3D ábra). Hasonló megfigyeléseket tapasztaltunk siRNS-sel RAR, RXR, vagy mind RAR, mind RXR leütés megcélzásához ATRA-val kezelt C3H10T1/2 sejtekben, összehasonlítva a DMSO-val és a nem célzó siRNS-kontrollokkal (1. ábra csak az interneten elérhető adatkiegészítésben). Ezek az adatok arra utalnak, hogy mind a RAR, mind az RXR szükséges a közvetítéshez Sox9 elnyomás és meszesedés aktivált RA jelzéssel. Összhangban csökkentett Sox9 expresszió a 3. ábrán, a meszesedésre utaló von Kossa reaktivitás szignifikánsan megnő a madár mitrális szelep explantánsainak ATRA és 9-cis kezelésével, és ez a fenotípus elvész, ha LE540, PA452 vagy mindkét antagonista együtt kezelik (4. ábra).

4. ábra. A retinsavkezelés elősegíti a meszes csomóképződést a cE10 mitralis szelep explantánsaiban. Összehasonlítva a jármű kezelőszerveivel (A), von Kossa reaktivitása megnő az all-transz retinsavval (ATRA) (B) és a 9-cisz RA (E). von Kossa reaktivitása gyengül, ha együtt kezelik farmakológiai antagonistákkal (C, D, F-H). én, A von Kossa reaktivitás mennyiségi meghatározása területre normalizálódott, amit az alciai kék ellenfestés jelez. A DMSO dimetil-szulfoxidot jelöl. *P

RARa és RARb, g A madárszelep-explantánsok agonista kezelése elnyomja Sox9 és Col2a1 Kifejezés és promóciók Spp1

5. ábra. Specifikus retinsav receptor (RAR) izoform agonistákkal végzett kezelés elősegíti az oszteogén gének expresszióját a porcos markerek rovására. A, Kvantitatív polimeráz láncreakció, hogy megmutassuk a RARb expresszió cE10 vagy posztnatális egér aorta szelep (AoV) explantánsok RARa- (AM580) és RARb, g, specifikus (Adapalene) agonistákkal történő kezelése után a vivőanyag-kontrollokhoz viszonyítva. B és C, Kvantitatív polimeráz láncreakció az oszteogén (Spp1) és porcos (Sox9, Col2a1) gén expresszió a kezelések után. *P

A Microarray elemzés jelentős változásokat tár fel a csontfejlődéssel és az ECM-mel összefüggő gén expressziós profilokban az egér aortás szívszelepekben rövid távú ATRA kezelés után

asztal. Az ATRA-val kezelt aortaszelep-explantánsok mikrorajzolásának génontológiai elemzése a DMSO járművezérlőkkel összehasonlítva a csontfejlődés és az extracelluláris mátrix génprogramjainak gazdagítását mutatja be.

Az ATRA all-transz retinsavat jelent; és DMSO, dimetil-szulfoxid.

Vita

Ebben a tanulmányban meghatároztuk az étrendi A-vitamin feleslegének a szívbillentyű szerkezetére és működésére gyakorolt hatásait, és megvizsgáltuk a szelepek génexpressziós profiljának RA-indukálta változásainak hátterében álló jelátviteli mechanizmusokat. Megmutattuk, hogy az egerekben a hosszú távú hypervitaminosis A aorta szelep szűkületéhez és szórólap meszesedéshez vezet, amely in vivo fokozott osteogén gén expressziós profilokkal jár. Megalapozott in vitro szelepes explant tenyészrendszerrel azt is megállapítottuk, hogy az RA által indukált meszesedési jelek RAR és RXR révén, és Sox9 a célgének elnyomása és diszregulációja, beleértve a csökkent gént Col2a1 és nőtt Spp1. Ennek alátámasztására a mikroarray eredmények génontológiai elemzése azt mutatja, hogy a csontfejlődéssel és az ECM folyamatokkal összefüggő génexpressziós próbakészletek gazdagodnak az ATRA-val kezelt egér aorta szelepes explantánsokban. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a RA szignalizációt szigorúan kell szabályozni felnőtt egerekben a szívbillentyű kötőszövet homeosztázisának fenntartása érdekében. Ezen tanulmány eredményei azt sugallják, hogy a retinoidok túlzott expozíciója hozzájárulhat a CAVD megjelenéséhez és progressziójához az emberi populációban.

Az A-vitamin túlzott étrendi bevitele elősegíti az egerek szelepdiszfunkcióját

Az RA-kezelés elősegíti az oszteogén és elnyomja a porcszerű folyamatokat a felnőtt szívbillentyű kötőszövetében

Az A hipervitaminózis mint a CAVD modellje

Összegzés és klinikai perspektívák

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Blair Austinnak, Agata Levay-nek és Ge Tao-nak a technikai segítséget és Dr. T. Michael Underhill-nek a reagensek megosztását. Ezenkívül köszönetet mondunk Dr. David Willoughbynak (Ocean Ridge Biosciences, LLC) a mikrorajz tanulmány elvégzéséért.