Az életkor és a szex, mint zavaró tényezők a szív mitokondriális funkciója és a 2-es típusú cukorbetegség összefüggésében a nílusi fű patkányában

Jillian Schneider

1 Kar Saint-Jean, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

2 Élettani Tanszék, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Woo Hyun Han

1 Kar Saint-Jean, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

3 Szemészeti és Látástudományi Tanszék, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Rebecca Matthew

1 Kar Saint-Jean, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Yves Sauvé

2 Élettani Tanszék, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

3 Szemészeti és Látástudományi Tanszék, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Hélène Lemieux

1 Kar Saint-Jean, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

4 Orvostudományi Osztály, Női és Gyermekegészségügyi Kutatóintézet, Alberta Egyetem, Edmonton, Alberta, Kanada

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

Az öregedés a 2-es típusú cukorbetegség (T2DM) és a kapcsolódó szív- és érrendszeri betegségek domináns kockázati tényezője [1, 2]. A T2DM világméretű előfordulási gyakorisága 1980 és 2014 között 108-ról 422 millióra nőtt, és a felfelé tartó trend továbbra is fennáll [3]. A szív- és érrendszeri szövődmények jelentik a halálozás első számú okát a T2DM-es betegeknél; a szövődmények közé tartozik a felgyorsult ateroszklerózis, a szisztolés és a diasztolés diszfunkció, a bal kamrai hipertrófia, a pitvari fibrózis és a fibrilláció, a szívelégtelenség és a fokozott myocardialis infarctus-halálozás [4]. A kardiomiocitákban az inzulin és a táplálkozási jelátvitel az anyagcsere fő szabályozójaként működik, biztosítva a megfelelő glükózválasz, lipidémia, oxidatív stressz, gyulladás, kalciumkezelés, apoptózis és mitokondriális funkció fenntartását [5]. A mitokondriumok kiemelkedő szerepét a T2DM-ben alátámasztják azok a megállapítások, amelyek szerint az inzulinrezisztencia mérséklése szintén javítja a mitokondriumok egészségét [6].

Az emberi szívnek jelentős mennyiségű ATP-re van szüksége, hogy naponta körülbelül 100 000-szer dobogjon. A szívizom által elfogyasztott ATP körülbelül 95% -a a mitokondriumban elhelyezkedő oxidatív foszforilációs (OXPHOS) folyamatból származik [7]. Az elektronok a belső mitokondriális membránban lévő elektronátviteli utakon (ET-utakon) haladnak, miközben a protonok a membránok közötti térbe pumpálódnak; ezzel létrejön egy protongradiens, amelyet az ATP-szintáz használ az ADP foszforilezésére ATP-vé. Egészséges kardiomiocitákban az ATP több mint 60–70% -a zsírsavakból származik, mint elektrondonor; a fennmaradó elektronokat glükóz-, laktát-, aminosav- vagy ketontestek oxidációjából nyerik [7]. Az oxigén végső elektron-akceptorként működik. Az ET-utakból szivárgó elektronok részlegesen csökkenthetik az oxigént, reaktív oxigénfajokat (ROS) termelve. A mitokondriális anyagcsere változásai nemcsak az energetikai állapotot, hanem a ROS termelését is befolyásolják; ezek egyidejűleg befolyásolják a sejtek öregedését.

Szív mitokondriális hibákat írtak le a T2DM-ben (áttekintette [8]); a jelentett változások a különféle mitokondriális ET-út komplexek kapacitásában/aktivitásában/tartalmában [9–15], a piruvát-dehidrogenáz komplex (PDC) aktivitásában [16–18], a kapcsolásban [15, 19], az oxidatív stresszben [20, 21] ], mitokondriális tartalom [9, 17], mitokondriális légzés, amelyet zsírsav szubsztrátok támogatnak [9, 13, 17, 22–24], és mitokondriális hálózat fragmentációja [19]. Az irodalmi eredmények többnyire egyetlen időpontot képviselnek, a hiperglikémia megjelenése után és/vagy a gyors T2DM progresszió modelljeiben. Az embereknél a cukorbetegség lassan fejlődő betegség, 65 éves életkor után 2,5-szeresére nő [25]. Az öregedés előrehaladtával a T2DM-ből fakadó mitokondriális diszfunkciók összezavarodnak az önmagában az öregedésnek tulajdonítottakkal [26–28], ami megnehezíti a mitokondriális diszfunkció T2DM-ben betöltött szerepének megértését.

Vizsgálatunk három elhanyagolt tényezővel kíván foglalkozni, amelyek zavarják a szív mitokondriális diszfunkciójának a T2DM-ben betöltött szerepének megértését. Az első a betegség korai szakaszával foglalkozik, a hiperglikémia előtt. A második a komplex és folyamatos öregedési folyamatok, amelyek egyidejűleg fordulnak elő a betegséggel és a mitokondriumokra gyakorolt hatással. A harmadik a nemi dimorfizmus, amely nemcsak a T2DM-mel, hanem az öregedéssel [38, 39] és a szív- és érrendszeri betegségekkel [40] is összefügg. Gyanítjuk, hogy ezeknek a szempontoknak az együttes kezelése jelentheti a kulcsot a mitokondrium szerepének a T2DM-hez és az öregedéshez kapcsolódó kardiovaszkuláris patológiákban való meghatározásához. A nőstények bevonásával kísérleti tervezésünkbe azt is megvizsgáljuk, hogy az MCD milyen hatással van a szív mitokondriális károsodásának megelőzésére, mind hiperglikémia jelenlétében, mind annak hiányában.

Anyag és módszerek

Állatok

A Nílusfüves patkányokat (Arvicanthis niloticus) 14: 10 órás világos-sötét ciklusban, 21 ± 2 ° C-os szobahőmérsékleten tartottuk.

40% relatív páratartalom. 21–23 napos elválasztás után a hím és nőstényt két étrendi csoportra osztották: 1) MCD csoport, Mazuri® csincsillával etetve (5M01, Purina Mills, LLC, St. Louis, MO, USA; 4,0% zsír, 15,3 % rost, 21,6% fehérje); 2) SRCD csoport táplálta Prolab®-ot (RMH 2000, 5P06, LabDiet, Nutrition Intl., Richmond, IN, USA; 9,6% zsír, 3,2% rost, 19,9% fehérje). Az állatok ad libitum eledelt és vizet kaptak. A metabolikus fenotípust és a szív mitokondriális funkcióját 2, 6 és 18 hónapos biológiai életkorban mérték. 16–18 órás éhezési időszak előzte meg a vér- és szövetgyűjtést. Valamennyi kísérletet jóváhagyta az Alberta Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága (328. protokoll) és az NIH (USA) irányelvei az állatok gondozására és kísérleti eljárásokra történő felhasználására vonatkozóan.

Metabolikus fenotípus

Az állatokat 480 mg kg -1 eutanil intraperitoneális injekciójával eutanizáltuk (Bimeda-MTC Animal Health, Inc., Cambridge, ON, Kanada). Az állatokat ezután megmérjük, megmérjük, és az éhomi plazma inzulin és az éhgyomri vércukor (FBG) szintjét az előzőekben leírtak szerint értékeljük [41]. Az éhomi inzulinszint> 2 ng ml -1 kompenzációt jelzett, az FBG pedig> 5,0 mmol l -1 hiperglikémiát tükrözött [29].

Szív permeabilizált rostkészítmény

Az egész szív az eutanázia után azonnal összegyűlt, és a Jéghideg izomlazító BIOPS oldatba merült [42]. Körülbelül 30 mg bal kamrai szövetet visznek a csúcsból friss jéghideg relaxáló oldatba. A szálakat csipesszel mechanikusan permeabilizáltuk, majd 30 percig 4 ° C-on 50 μg ml -1 szaponinnal kiegészített relaxációs oldatban óvatosan kevertük [43]. A szálakat 10 percig jéghideg mitokondriális légzőközegben, MiR05 keveréssel mossuk [44]. Ezután a rostokat elfoltoztuk, súlyoztuk, és azonnal felhasználtuk a respirometrikus mérésekhez.

Nagy felbontású respirometria

Asztal 1

Protokollok Szubsztrát-kombinációk (telített ADP-vel és citokróm c-vel) Pályák Mért specifikus komplexek, enzimek és transzporterek

1	Piruvát + malát (PM)	NADH	I. komplexum
			Piruvát-dehidrogenáz komplex
			Piruvát transzporter
1	Piruvát + malát + szukcinát (PMS)	NADH és szukcinát	I. és II
			Piruvát-dehidrogenáz komplex
			Piruvát transzporter
			Szukcinát-dehidrogenáz
1	Szukcinát + rotenon	Szukcinát	Komplexumok II
			Szukcinát-dehidrogenáz
1	Aszkorbát + TMPD (-azid háttér)	-	Komplex IV egylépéses
2	Palmitoil-karnitin + malát	ETF	Hosszú láncú zsírsav oxidáció
			Karnitin transzlokáz
			Karnitin-palmitoil-transzferáz-II
3	Oktanoil-karnitin + malát	ETF	Közepes láncú zsírsav oxidáció
			Karnitin transzlokáz
			Karnitin-palmitoil-transzferáz-II
4	Acetilkarnitin + malát	ETF	Karnitin-acetil-transzferáz
			Karnitin transzlokáz

ETF, elektrontranszfer flavoprotein; TMPD, N, N, N, N-tetrametil-p-fenilén-diamin

A mitokondriális funkció adatait vagy tömegre jutó oxigén fluxusként (minden protokoll esetében), vagy fluxuskontroll arányként (FCR) mutatjuk be, normalizálva a maximális OXPHOS kapacitásra olyan szubsztrátok jelenlétében, amelyek elektronokat táplálnak egyidejűleg a NADH és a szukcinát útvonalakba (az 1. protokoll esetében ). Minden kísérleti kísérlet végén a kamra tartalmát eltávolítottuk, és a kamrát kétszer öblítettük 500 μl MiR05-tel. A szálakat kétszer, 30 másodpercig jégen, üvegfazekasokkal homogenizáltuk és azonnal -80 ° C-on tároltuk a citrát-szintáz (CS) méréséhez, a korábban leírtak szerint [41].

Adatelemzés

A statisztikai elemzéseket a SigmaPlot 14 (Systat Sofware Inc., San Jose, CA, USA) segítségével végeztük. A grafikákat a GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, Inc., La Jolla California) segítségével készítettük. Az ANOVA normalitásának és a variancia homogenitásának kritériumait minden változóra Kolmogorov-Smirnov (Lilliefor korrekciója), illetve Brow-Forsythe tesztekkel teszteltük. A mitokondriális funkció és az anyagcsere-fenotípus adatait ezután háromutas ANOVA-val elemeztük, amelynek három tényezője a nem, az étrend és az életkor volt, majd páronkénti Tukey-tesztek követték. Néhány változót átalakítottak, hogy megfeleljenek az ANOVA kritériumainak, és az egyes transzformációk az egyes ábrákon vannak feltüntetve. Az adatokat transzformáció nélküli mediánban (min – max) mutatjuk be, ahol N az állatok száma, és n az oxigraf vizsgálatok száma. A p 1. ábra) az SRCD-vel táplált hímek testtömege nagyobb volt, mint az MCD-vel táplált férfiak testtömege; szignifikanciáját azonban csak a 6. és 18. hónapban érte el (1A. ábra). Hasonló eredményeket kaptak a nőknél is, de erősebb elkülönítéssel az étrendi csoportok között 2 és 18 hónapos korban (1B. Ábra). A testtömeg-index (BMI) (1C. És 1D. Ábra) a férfiak és a nők közötti elhízás-összehasonlítás jobb mutatóját képviseli, mivel figyelembe veszi a nőstények kisebb hosszúságát. A BMI az SRCD csoportban is magasabb volt. A táplálkozási csoportok közötti jelentőséget 18 hónapos korban érték el a férfiaknál (1C. Ábra) és 6 és 18 hónapos korban a nőknél (1D ábra). A BMI esetében nem volt interakció a nem és az étrend között (p = 0,268), ami azt jelzi, hogy az étrend mindkét nemnél hasonló hatású.

A hímek (bal oldal) és a nőstények (jobb oldal) metabolikus fenotípusa. Nílusfű patkányok három különböző életkorban (2 hónap) táplálták a Mazuri Chinchilla diétát (MCD csoport, fekete négyzetek) vagy a Standard Rodent Chow Dietot (SRCD, szürke háromszögek)., 6 hónap és 18 hónap). A mért paraméterek a testtömeg (A, B), a testtömeg-index (BMI; B, C), az éhomi vércukorszint (FBG; E, F) és a plazma inzulin (G, H). A pont ábrázolja az egyes adatpontokat és a mediánt. Az étrendi (szürke) vagy az életkor (fekete) csoportok közötti jelentős különbségeket *** jelzi, p 1E és 1F ábra, jobb oldal). A hímeknél az FCD volt magasabb az SRCD csoportban, mint az MCD csoportban a 6. és 18. hónapban, míg a szignifikancia csak 18. hónapban volt elérhető, az SRCD csoportban mutatkozó nagy változékonyság miatt (1E. Ábra). Ezzel szemben a nőstények az egész életkorban normális szinten megőrizték FBG-jüket (1F. Ábra). A plazma inzulint jelentősen befolyásolta az életkor (p = 0,027 2 és 6 hónap között; p = 0,005 2 és 18 hónap között; Tuckey páros összehasonlítás) és az étrend (p = 0,010 az MCD és az SRCD csoport között; Tuckey páros összehasonlítás), de nem nem szerint (p = 0,495). Ezenkívül a plazma inzulinszintje egyik faktorának sem volt szignifikáns kölcsönhatása. Regresszióanalízist is végeztünk a BM és az inzulinszint között, gyenge, de szignifikáns összefüggést mutatva mindkét nemnél (R 2 = 0,216 és 0,317, férfiaknál és nőknél).

A citrát szintáz aktivitását befolyásolja az életkor és az étrend, de csak a férfiaknál

A citrát szintáz (CS) aktivitása a hímek (A) és a nőstények (B) szívrostjaiban. A Nílusfű patkányai a Mazuri Chinchilla Diet-et (MCD csoport, fekete négyzetek) és a Standard Rodent Chow Diet-et (SRCD, szürke háromszögek) táplálták háromnál. különböző korúak (2 hónap, 6 hónap és 18 hónap). Az adatokat az átlagos CS-aktivitás (IU g -1 szívrost) doboz- és bajusz diagramjaként mutatjuk be. A bal oldali grafikon a férfi adatokra, a jobb oldalon pedig a női adatokra vonatkozik. A pont ábrázolja az egyes adatpontokat és a mediánt. N = 4–12 állat csoportonként és n = 7–16 rostkészítmény csoportonként. A háromutas ANOVA-k eredményei a jobb oldalon, a kétirányú ANOVA-k pedig az egyes paneleken találhatók. Az étrendi csoportok (a felső, szürke) és az életkorcsoportok (az alsó, fekete) közötti jelentős különbségeket *** jelzi a p esetében 3A és 3B; jobb oldali), de a korhatás a kétirányú ANOVA-ban csak a nőstényekre (p = 0,022) és nem a férfiakra (p = 0,525) vonatkozott. Ezzel szemben a tömegenként fluxusban kifejezett szukcinát útvonal nem mutatott szignifikáns változásokat az életkor, a nem vagy az étrend függvényében (3C. És 3D ábra). Az életkor és az étrend azonban szignifikáns kölcsönhatást mutatott, amelyet a kapacitás növekedése mutatott az SRCD-csoportban az MCD-csoporthoz képest 6 hónapos korban (p = 0,022, nemek zavarosak). A mitokondriális tartalom 2 hónapos növekedése az SRCD-vel táplált hímeknél az MCD-vel táplált férfiakhoz képest (2A. Ábra) nem eredményezte a NADH vagy a szukcinát útvonalnál nagyobb tömeg/tömeg fluxusképességet (3A. És 3C. Ábra).

A IV komplex relatív kapacitása az életkor és az étrend szerint változott, de csak a férfiaknál

Az aszkorbáttal és a TMPD-vel táplált elektronok a IV komplexbe mért komplex IV aktivitás nem mutatott szignifikáns változást az életkor, a nem vagy az étrend függvényében, ha tömegre vonatkoztatott fluxusban fejeztük ki (4A és 4B ábra). Howerver, a háromutas ANOVA az FCR-en a nem jelentős hatását mutatta (p = 0,005), valamint kölcsönhatásokat mutatott a nem és az életkor (p = 0,008), valamint a nem és az étrend között (p = 0,009; 4C és 4D ábra) . A IV komplex változásai a hímekre korlátozódtak (4C. Ábra). A 2 hónapos férfiak magasabb FCR-értéket mutattak a IV komplexben az SRCD-ben az MCD-csoporthoz képest (p = 0,004), és ezt az életkor csökkenése követte (p = 0,015 2 és 18 hónapos kor között; 4C. Ábra) . Az MCD csoportban a IV komplex FCR-je 2 hónapnál alacsonyabban kezdődött, 6 hónaposan nőtt (anélkül, hogy szignifikanciát ért volna el), majd jelentősen csökkent 6-ról 18 hónapra (p = 0,029) (4C. Ábra). A nőstények ezzel ellentétben nem mutattak semmilyen változást az FCR-ben az életkorral vagy az étrenddel járó IV-es komplexben (4D. Ábra). Összességében a IV komplex FCR-je az ET-útvonal egyetlen része, amelyet az étrend és az életkor befolyásolt, és ismét csak a hímeknél.

LEAK légzés hím (A) és nőstény (B) bal kamrák permeabilizált szívrostjaiban. A Nile Grass patkányok a Mazuri Chinchilla Diet (MCD csoport, fekete négyzetek) és a Standard Rodent Chow Diet (SRCD csoport, szürke háromszögek) diétákkal táplálták, három életkor (2 hónap, 6 hónap és 18 hónap). A LEAK-t szubsztrátok jelenlétében tápláltuk be a NADH útvonalba (piruvát és malát) és ADP hiányában. A LEAK légzési arányt FCR-ben fejezzük ki, a maximális OXPHOS kapacitás felett, a szubsztrátok egyidejűleg táplálnak elektronokat mind a NADH, mind a Succinate útba. A pont ábrázolja az egyes adatpontokat és a mediánt. A kocka gyökér transzformációkat alkalmaztuk a háromirányú ANOVA feltételezésének teljesítéséhez. N = 3–7 állat csoportonként és n = 4–12 rostkészítmény csoportonként.

Mitokondriális külső membrán integritása

Köszönetnyilvánítás

Hálásak vagyunk Sharee Kunynek az NR kolónia kezelésében, az eredmények elemzésében és a kézirat szerkesztésében nyújtott segítségért. Köszönjük Roshani Payoe szerkesztői véleményét.

Finanszírozási nyilatkozat

A finanszírozást az NSERC felfedezési támogatása (RGPIN 402636), a Kanadai Alapítvány az Innovációs Eszközökhöz nyújtotta támogatás (12979) és a Saint-Jean kari támogatás adja a HL-nek, valamint a kanadai egészségügyi intézetek (CIHR; MOP 125873) az YS-hez. JS Frederick Banting és Charles Best Canada Graduate ösztöndíjat és II. Erzsébet királynő ösztöndíjat kapott; A WHH megkapta az Alberta Egyetem Orvostudományi és Fogorvosi Karának 75. évfordulójának ösztöndíját; YS megkapta az Alberta Heritage Foundation for Medical Research Senior ösztöndíjat (200800242).