Az elhízás taxonómiai aláírása a mikrobiomban? Eljutás az anyag beléhez

Tartozás A J. David Gladstone Intézetek, San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Jelenlegi cím: Mikrobiológiai és Statisztikai Tanszék, Oregoni Állami Egyetem, Corvallis, Oregon, Amerikai Egyesült Államok

Tartozás A J. David Gladstone Intézetek, San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Kapcsolatok A J. David Gladstone Intézetek, San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok, Humángenetikai Intézet és Epidemiológiai és Biostatisztikai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, San Francisco, San Francisco, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok

Mariel M. Finucane,
Thomas J. Sharpton,
Timothy J. Laurent,
Katherine S. Pollard

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Finucane MM, Sharpton TJ, Laurent TJ, Pollard KS (2014) Az elhízás taxonómiai aláírása a mikrobiomban? Eljutás az anyag beléhez. PLoS ONE 9 (1): e84689. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084689

Szerkesztő: Markus M. Heimesaat, Charité, Campus Benjamin Franklin, Németország

Fogadott: 2013. május 28 .; Elfogadott: 2013. november 26 .; Közzétett: 2014. január 8

Finanszírozás: Ezt a munkát a Nemzeti Tudományos Alapítvány (DMS-1069303 számú támogatás) és a San Simeon Alap ajándéka támogatta. Támogatást nyújtott az NIH Human Microbiome Project - A mikrobiom mintavételi protokoll A (HMP-A) fejlesztéséhez az NIH orvosi kutatási ütemterve. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az elhízás korunk meghatározó közegészségügyi kihívásai közé tartozik, becslések szerint évi 3,4 millió halálesetet tulajdoníthatnak a magas BMI-nek [1]. A diétás és életmódbeli beavatkozásoknak csak szerény hatása van, és nem világos, hogy ezek az előnyök idővel fennmaradnak-e [2]. Így jelentős az érdeklődés a fogyás alternatív megközelítései iránt.

Az utóbbi években egy csábító új elmélet jelent meg, amely arra utal, hogy a bél mikrobioma terápiás célpontot kínálhat. Támogatva a bélmikrobák kauzális szerepét az elhízásban, egereken végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az elhízás sovány egyéneknél elhízott személyek széklettranszplantációival indukálható [3], [4]. Míg azok a mechanizmusok, amelyek révén a bélmikrobák befolyásolják a BMI-t, nem ismertek, a bélmikrobiom összetételének többszörös vizsgálata mind egerekben, mind emberekben azt mutatta, hogy az elhízott egyéneknél alacsonyabb a baktériumok aránya a törzs Bacteroidetes és a Phylum Firmicutes baktériumok között, mint a sovány egyedek [3], [5] - [7]. Az elhízott egyénekről kiderült, hogy kevésbé változatos baktériumközösségek is vannak [7], [8].

Mind a tudományos szakirodalom [9], [10], mind a közönséges sajtó [11] határozott megállapításként hirdette meg az elhízás és a Bacteroidetes vs. Firmicutes relatív bőségének összefüggését. Számos friss jelentés azonban megkérdőjelezi ennek az egyesületnek az erejét. Két nagy tanulmány nem talált összefüggést az elhízás és a Bacteroidetes: Firmicutes arány között [12], [13]. Ezenkívül számos publikáció valójában a Bacteroidetes és a Firmicutes arányának magasabb arányáról számol be az elhízott emberek körében [14], közvetlenül ellentmondva az eredeti megállapításoknak.

A Human Microbiome Project (HMP) konzorcium összegyűjtötte a legnagyobb meglévő, egészséges egyének mikrobiotáját leíró adatsort, szigorú minőségellenőrzéssel kurált szekvenciákkal. A kohorsz tartalmazza a Houstonban és Saint Louis-ban élő több mint 200 felnőtt székletmikrobiómájának 16S rRNS-szekvenálását [15], és átfogó BMI-értékekkel rendelkező alanyokat tartalmaz, köztük 24 elhízott () és 123 sovány () egyént. Ezek az adatok lehetőséget nyújtanak a bél mikrobiomjának taxonómiai összetételével és az elhízással kapcsolatos ellentmondásos eredmények vizsgálatára.

Eredmények

A Bacteroidetes: Firmicutes arány nem társul elhízással vagy BMI-vel

Azzal kezdtük, hogy megkíséreltük megismételni a legismertebb eredményt, amely alátámasztja azt az elméletet, miszerint az elhízott egyének bélében alacsonyabb a Bacteroidetes és a Firmicutes aránya. Nem találtunk különbséget az elhízott és a sovány egyedek között a Bacteroidetes vagy Firmicutes relatív bőségében (p = 0,30, illetve 0,86, -teszt alapján).

Fontos, hogy nem sikerült észlelni ezeket a különbségeket nem az elégtelen statisztikai erő miatt. A mintanagyságainkkal és a korábban közölt hatásméretekkel nagyon valószínűtlen, hogy nem találtunk összefüggést a HMP-adatokban, ha a St. Louis és Houston populációkban létezne asszociáció. Például Turnbaugh et al. [7] Az európai amerikaiak 16S rRNS génjének V6 régiója esetében 96% -os erővel rendelkeznénk a Bacteroidetes relatív bőségében és a Firmicutes esetében 80% -ban a különbség kimutatására. Ezek a teljesítményszámítások azt a tényt tükrözik, hogy az elhízott egyének aránya a HMP kohorszban alacsonyabb, mint a [7].

Mivel a túlsúly káros egészségügyi hatásai a BMI-értékek folytonossága mentén jelentkeznek, és nem csak az elhízás-határérték (BMI) felett, ezért a következõ mennyiségi összefüggést kerestük a folyamatos BMI-változó és a Bacteroidetes és a Firmicutes aránya között. Nem volt összefüggés (1. ábra; lineáris regresszió p = 0,41), és ez az arány nagyban változott az egyének között, BMI-től függetlenül.

A taxonómiai összetétel alternatív számszerűsítése szintén nem társul a BMI-vel

Ezután megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy - a BMI-vel való összefüggés kimutatása céljából - a Bacteroidetes és a Firmicutes aránya nem foglalta össze megfelelően a bél mikrobiom taxonómiai összetételét a menedékjog szintjén. Pontosabban meghatároztuk az öt fő baktérium phyla relatív bőségét az egyes mintákban, és mindegyikhez létrehoztunk egy menedék szintű kompozíciós profilt. Ezután ezeket a kompozíciós profilokat a BMI függvényében vizualizáltuk. Nem volt látható jel (2. ábra).

Minden sor mutatja a fő bélbaktériumok phyla relatív bőségét egy egyedben. Az egyéneket a BMI szerint rendezik meg.

Ezután annak biztosítása érdekében, hogy ne maradjon le egy finom mintázat ebben a diagramban, statisztikai modellt alkalmaztunk a BMI hatások elkülönítésére a maradék varianciától a mintavételi és mérési hibák miatt. Konkrétan, az egyes főbb patkányok relatív bőségének izometrikus logaritmus-transzformációját [17] modelleztük az egyes mintákban, lineáris modell alkalmazásával, amely magában foglalja a törzs rögzített hatását, valamint a BMI törzsspecifikus hatását, valamint egy véletlenszerű hibatagot. Ismét nem találtunk szignifikáns összefüggést a BMI és a taxonómiai összetétel között a menekültügyi szinten.

Majd megvizsgáltuk annak lehetőségét, hogy a BMI szövetség finomabb taxonómiai megoldással létezzen, annak ellenére, hogy a menekültügyi szinten nincs társulás. Minden egyén számára létrehoztunk egy új taxonómiai összetételi profilt, amely számszerűsítette az egyes baktériumok nemzeteinek relatív bőségét az egyedek széklet mikrobiomjában. A főkomponensek elemzését alkalmaztuk ezekre a nemzetségi profilokra, hogy mérsékeljük azok dimenzióit, ahogy Smith és mtsai. [18]. Ezután teszteltük, hogy van-e összefüggés a BMI és az első hat fő komponens bármelyike között (ez magyarázza a nemzetségszintű profilok varianciájának 96% -át). Nem találtunk jelentős társulást.

Ezen felül annak biztosítására, hogy a fő komponensek redukciója ne takarja el az asszociációt, logisztikai regresszióval modelleztük az egyes fő nemzetek megfigyelésének valószínűségét a BMI függvényében. Megint nem találtunk társulást.

A bél mikrobiom közösség sokfélesége nem társul a BMI-vel

Végül azt a hipotézist vizsgáltuk, hogy a BMI nem az egyes taxonok relatív bőségével, hanem a jelen lévő taxonok sokféleségével van összefüggésben. Ezt a lehetőséget Turnbaugh et al. [7] és Le Chatelier et al. [8], akik mindketten arra a következtetésre jutottak, hogy a sokféle bélmikrobióm védőhatással bírhat az elhízás ellen. Turnbaugh et al. Megközelítését követve. [7], a ritkasággörbék kiszámításához a HMP-minták 97% -os azonosságú operatív taxonómiai egységének (OTU) hívásait alkalmaztuk a szekvenciaolvasásokkal. Ezután ezeket a görbéket használtuk az elhízott és a sovány egyének gazdagsági szintjének (azaz az OTU-k teljes számának) összehasonlítására. A [7] és [8] eredményekkel ellentétben nem találtunk összefüggést a gazdagság és az elhízás között, inkább megfigyeltük az OTU-gazdagság nagyfokú maradék változékonyságát az egyének között.

Annak biztosítására, hogy ezek a meglepő eredmények ne a sokféleség mérésének vagy számítási eljárásnak az eredményei legyenek, a Shannon-entrópia mértékével, valamint számos mikrobiális ökológiai elemző szoftvercsomaggal (mothur [19], QIIME [20] és MetaPhlAn) validáltuk eredményeinket. [21]). Ez az érzékenységi elemzés megerősítette, hogy a null diverzitás eredményeink robusztusak.

Az elhízás hatása a vizsgálatok során nem következetes

Annak biztosítása érdekében, hogy megismételhessük a korábbi elemzések [6], [7] jelentős megállapításait, és felmérhessük, hogy egy másik nagy, nemrégiben végzett tanulmány, szélesebb körű BMI-értékekkel (MetaHIT [16]) segíthet-e az ellentmondásos eredmények tisztázásában, újra elemezte a [6], [7] és a dán alanyok [16] adatait. Bár a jelen kézirat elsődleges elemzései a 16S rRNS gén V35 régiójára korlátozódtak, a V13 régióból származó HMP adatokat is bevontunk annak értékelése érdekében, hogy egy 16S régióra specifikus torzítás elfedheti-e a valódi mögöttes kapcsolatot.

A 3. ábrán megmutatjuk, hogy a Firmicutes és Bacteroidetes relatív bőségének eltérései sokkal nagyobbak a vizsgálatok között, mint bármelyik tanulmányban a sovány és elhízott egyének között. A MetaHIT és a HMP eredményei nem csak összefoglalják Ley és Turnbaugh megállapításait, hanem valóban az ellenkező irányba mennek. A HMP-adatokban ez a megállapítás következetes a 16 S lokusz V13 és V35 régióiban, mindkettőt ugyanazon személyeken szekvenálták ugyanazon a platformon (Roche 454). A tanulmányok közötti jelentős változékonyság oka lehet egy nem mért tényező, például az étrend [22], vagy olyan technikai tényezők, mint a DNS-kivonási technika, a megcélzott 16S-lokusz régiója vagy a szekvenálási platform [23]. Mindazonáltal a V13 és V35 régiók BMI-asszociációjának hiánya a HMP-adatokból arra utal, hogy a 16S régió nem jelent nagyobb zavarót, legalábbis ebben a kohorszban és e két változó régióban.

A Ley-adatok [6] származnak. A „Turnb”. az adatok Turnbaugh et al. [7], afroamerikaiaktól (AA) és európai amerikaiaktól (EA), változó régiókból (V) 2 és 6. A HMP-adatok a V13 és V35-ből származnak. Megjegyezzük, hogy a kézirat elsődleges eredményei a HMP V35 adatainak felhasználásával készültek. Minden p-érték -teszt segítségével.

Vita

Az egereken végzett széklettranszplantációs vizsgálatok meggyőzően kimutatták, hogy a mikrobiom ok-okozati hatást gyakorol az elhízásra [3], [4], és számos nagy horderejű tanulmány megállapította, hogy az elhízott egyéneknél alacsonyabb a Bacteroidetes és a Firmicutes aránya [3], [ 5] - [7]. Mégis, mi és mások nem találtunk összefüggést a BMI és a bélmikrobiómák menedék szintű összetétele között nagyszabású elemzések során [12], [13]. Ezek az ellentmondásos megfigyelések arra utalnak, hogy a bél mikrobiomjában nem létezik az elhízás egyszerű taxonómiai aláírása.

Elsődleges elemzéseink korlátja, hogy csak a HMP kohorsz egészséges alanyaira korlátozódtak, egyiküknél sem volt BMI 35. Például feltételezzük, hogy a HMP egészségügyi szűrője kizárhatta az alacsony változatosságú egyéneket, így megzavarta a képességünket, hogy különbséget tenni az elhízás és a gazdagság között. Megjegyezzük azonban, hogy a dán MetaHIT kohorsz = 12 (17%) BMI 35 alanyot tartalmazott, és ennek ellenére nem tárt fel összefüggést az elhízás és a bél mikrobiom taxonómiai összetétele között.

Mód

Kiváló minőségű, taxonómiailag annotált Roche V35 16 S rRNS génszekvenciákat töltöttünk le a HMP Adatelemző és Koordinációs Központjából (www.hmpdacc.org). Ezek egy Roche 454 műszeren tömegesen szekvenált PCR-amplifikált V35 régiók. Ezeket a szekvenciákat korábban átfogó minőség-ellenőrzési elemzéseknek vetették alá [15], beleértve a vágást, a denoizálást és a kiméraszűrést. Minden szekvenciához kivontuk a menedékjogi szintű taxonómiai jegyzeteket és a bootstrap statisztikákat az RDP 2.2 osztályozón keresztül [27], az alapértelmezett 032010 képzési készlet és taxonómia, valamint az „allrank” kimeneti formátum opció segítségével, a HMP SOP szerint. A 80% -nál kisebb bootstrap statisztikájú kommentárokkal ellátott szekvenciákat „osztályozatlannak” tekintettük. A szekvenciákat ezután hozzárendelték a megfelelő HMP-minta azonosítójukhoz, és az egyes minták menedék szintű relatív bőségének kiszámításához használták őket. Azoknál az alanyoknál, akiknek több székletmintája volt, mivel a hosszirányú BMI-pálya adatai nem álltak rendelkezésre, a legnagyobb olvasási számú mintát elemeztük. Az összesen 217 rendelkezésre álló minta közül öt mintát kizártunk 1000 olvasással, így a teljes mintanagyságunk 212 mintára csökkent. Ugyanezt a megközelítést alkalmazták a HMP V13 16S rRNS génszekvenciák előállításához.

Megvizsgáltuk az arcsin négyzetgyök nemzetség relatív bősége és a HMP összes további kvantitatív fenotípusa közötti összefüggéseket. Nem találtunk szignifikáns (FDR-korrigált) asszociációt egyetlen testhelyzetben sem, ami megfelel a [13] mikrobafenotípusos asszociációk alacsony számának, és alátámasztja a BMI-vel kapcsolatos elsődleges megállapításaink érvényességét.

A MetaHIT adatait sörétes metagenómák alkották, amelyeket letöltöttünk az Európai Bioinformatikai Intézettől (www.ebi.ac.uk). Elemzésünket azokra a dán mintákra korlátoztuk, amelyek legalább 75 bázispár (bp) (= 70) olvasási hosszúságot tartalmaztak, és véletlenszerűen elemeztünk 20 M leolvasást minden mintából. Számszerűsítettük ezekből a mintákból a mikrobiomák menedék szintű sokféleségét az STAP adatbázis [28] és a GreenGenes adatbázis [29] felhasználásával, hogy azonosítsuk a 16 S lokusz metagenomikus homológjait és az RDP osztályozót e szekvenciák taxonómiai feljegyzéséhez. Statisztikai szimulációt végeztünk az optimális bootstrap statisztikai küszöbértékek azonosítására a 16 S RNS metagenómikus leolvasások phylába osztályozásához az RDP osztályozó segítségével. Röviden: a Grinder-t [30] használtuk 10 000 75 bp-os 16 S leolvasás szimulálására az STAP adatbázisból és a GreenGenes adatbázisból, valamint 90 000 75 bp-os leolvasást a J. Craigből véletlenszerűen kiválasztott 11 baktérium genom kódoló szekvenciájából (CDS). A Venter Intézet átfogó mikrobiális erőforrás-adatbázisa [31]. Minden olvasmányt besoroltunk az RDP osztályozó segítségével. Megállapítottuk, hogy a 70% -os bootstrap küszöb elkapta a szimulált 16 S szekvenciák 83% -át, és ezeknek az olvasásoknak 99% -át helyesen osztályozta, miközben a CDS-olvasások összesét, kivéve 0,001% -át, kiszűrte.

A Ley [6] és Turnbaugh [7] tanulmányok részeként létrehozott, nyilvánosan elérhető, kiváló minőségű 16 S amplikon szekvenciákat letöltötték, és taxonómiai szempontból jegyzetelték őket. Konkrétan 18 348 teljes hosszúságú 16 S-t gyűjtöttünk össze a [6] -ban létrehozott sörétes szekvenciákból a gordonlab.wustl.edu/microbial_ecology_ human_obesity/és 817 942 V6 hipervariábilis régiókból és 1 119 519 V2 változó régiókat a 16 S RNS piroszekvenáló szekvenciákból, amelyeket [7] generáltunk. a gordonlab.wustl.edu/NatureTwins_2008/ oldalról. Az összes szekvenciát a fent leírt RDP osztályozóval phylába soroltuk.

Szerző közreműködései

A kísérletek megtervezése és megtervezése: MMF TJS KSP. Elemezte az adatokat: MMF TJS TL. Írtam a papírt: MMF TJS TL KSP.