Az ösztrogén növényi kivonatok fordított súlygyarapodás és zsírfelhalmozódás emlőmirigy vagy méhproliferáció előidézése nélkül

Elise F. Saunier

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Omar I. Vivar

2 Táplálkozástudományi és Toxikológiai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Berkeley, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Andrea Rubenstein

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Xiaoyue Zhao

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Moshe Olshansky

3 Bioinformatikai osztály, The Walter és Eliza Hall Orvosi Kutató Intézet, Parkville, Victoria, Ausztrália,

Scott Baggett

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Richard E. Staub

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Mary Tagliaferri

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Isaac Cohen

1 Bionovo Inc., Emeryville, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Terence P. Speed

3 Bioinformatikai osztály, The Walter és Eliza Hall Orvosi Kutató Intézet, Parkville, Victoria, Ausztrália,

4 Statisztikai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Berkeley, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

John D. Baxter

5 Diabetes Központ és Rákkutató Egység, The Methodist Hospital Research Institute, Houston, Texas, Amerikai Egyesült Államok,

Dale C. Leitman

2 Táplálkozástudományi és Toxikológiai Tanszék, Kaliforniai Egyetem, Berkeley, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok,

Kialakította és megtervezte a kísérleteket: EFS DCL. Végezte a kísérleteket: EFS OIV AR. Elemezte az adatokat: EFS XZ MO TPS JDB DCL. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: SB RES MT IC. Írtam a cikket: EFS JDB DCL.

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

A menopauza a nők ösztrogénszintjének mélyen csökkenésével jár. Ez ösztrogénhiányhoz vezet, amely korai tüneteket vált ki, beleértve a hőhullámokat, a hangulatváltozásokat és a hüvelyi szárazságot, és hozzájárul hosszú távú állapotokhoz, például osteoporosishoz, és esetleg más krónikus állapotokhoz, beleértve a szív- és érrendszeri betegségeket, az elhízást, a 2-es típusú cukorbetegséget, a metabolikus szindrómát és az Alzheimer kór betegség. A posztmenopauzában lévő nőket gyakran kezelik menopauzás hormonterápiával (MHT), amely ösztrogéneket tartalmaz, amelyek nagyon hatékonyan megakadályozzák a hőhullámokat, az urogenitális atrófiát és az oszteoporózist [1]. A Women Health Initiative (WHI) vizsgálat [2], [3], a szív és ösztrogén/progesztin pótló tanulmány [4] és az ápolók egészségügyi tanulmánya [5] is megállapította, hogy az MHT csökkenti a 2-es típusú cukorbetegség kockázatát. Más vizsgálatok azt mutatják, hogy az MHT csökkenti a súlygyarapodást [6], [7] és megakadályozza a zsír újrafelosztását a hasüregben [8], [9]. E fontos előnyök ellenére a WHI kimutatta, hogy az MHT növeli az emlőrák, a vérrögök és a szív- és érrendszeri betegségek kockázatát [1], [10]. Bár ellentmondásos, az ösztrogének lehetséges l káros hatásai az MHT használatának jelentős csökkenéséhez vezetnek [11], és intenzív törekvés a biztonságosabb ösztrogének kifejlesztése az MHT-ban hosszú távú terápiára.

Az ösztrogéneket az MHT-ben sok évvel ezelőtt vezették be az ösztrogén receptor szignálozásában szerepet játszó tényezők tisztázása előtt. A főbb felfedezések között szerepel két ösztrogén receptor altípus azonosítása, a DNS szabályozó elemek több osztálya, amelyekhez az ösztrogén receptorok kötődnek a génekben, valamint számos olyan koregulátor fehérje és transzkripciós faktor, amelyek kölcsönhatásba lépnek az ER-ekkel, hogy megváltoztassák a kromatin szerkezetét a gén transzkripciójának szabályozására [12]. Ezek az izgalmas felfedezések lehetővé tehetik olyan ösztrogén-utánzók kifejlesztését, amelyek szelektívebbek és nem igényelnek progesztinek hozzáadását, amelyek súlyosbítják az ösztrogének emlősejtekre gyakorolt káros hatásait [13].

Az ERα hasznos metabolikus hatásainak kiaknázásának egyik stratégiája az a szövetszelektív ERα gyógyszerek azonosítása, amelyek agonistaként hatnak a zsírszövetben, de nem az emlőmirigyben (MG) vagy a méhben. Hatalmas erőfeszítéseket tettek az ösztrogének nagyobb szelektivitással történő azonosítására. Ezek nagy léptékű nagy átbocsátású szűréseket, röntgenkristályos megközelítéseket és más módszereket alkalmaztak. A nem szelektív ösztrogének mellett a menopauzás nők számára az ösztrogén gyógyszerek egyetlen csoportja a szelektív ösztrogén receptor modulátorok (SERM), például a raloxifen, amelyek vegyes agonista/antagonista aktivitással rendelkeznek [36]. Sok növény fitoösztrogént tartalmaz, amelyek az ösztradiolhoz hasonlóan transzaktiválják az ösztrogén receptorokat. Néhány fitoösztrogén szelektivitást mutat az ER altípusokkal szemben [37]. Ezért olyan növényekben kerestünk vegyületeket, amelyek számos gyógyszerkészítményt hoztak és népszerűek a nők körében [38], és olyan ösztrogéneket fedeztek fel, amelyek szövetspecifikus hatásokat mutathatnak, amelyek megakadályozhatják a metabolikus szövődményeket a menopauza idején. Itt olyan növényi kivonatok felfedezéséről számolunk be, amelyek ösztrogén aktivitással rendelkeznek, és megfordítják a súlygyarapodást és a zsír felhalmozódását anélkül, hogy az egerekben nem okoznának kellemetlen hatást az emlőmirigyre vagy a méhre.

Anyagok és metódusok

Növényi kivonatok

RG elkészítése

Öt kilogramm őrölt, szárított gyökér a Glycyrrhiza uralensis Fischer vagy a Glycyrrhiza glabra L .; A Fabaceae-t kétszer 25 liter 8-2 etanol-víz eleggyel extraháltuk 8 órán át és egy éjszakán át szobahőmérsékleten, állandó keverés közben. Az extraktumot leszívatjuk Whatman # 4 szűrőpapíron, és az egyesített szűrleteket csökkentett nyomáson 50 ° C-on körülbelül 2 literre bepároljuk az etanol eltávolítása céljából. A vizes frakciót fagyasztva szárítottuk, így stabil port kaptunk, amelyet a vizsgálat céljából meghatározott koncentrációra hígíthattunk.

Az RP elkészítése

Öt kilogramm őrölt, szárított gyökér Pueraria montana (Lour.) Merr. var. A lobata (Willd.) Maesen és S. Almeida (Fabaceae) növényeket kétszer 25 liter 8-2 etanollal - vízzel 8 órán át és éjszakán át szobahőmérsékleten, állandó keverés mellett extraháltuk. Az extraktumot leszívatjuk Whatman # 4 szűrőpapíron, és az egyesített szűrleteket csökkentett nyomáson 50 ° C-on körülbelül 2 literre bepároljuk az etanol eltávolítása céljából. Vizet adtunk hozzá, hogy a térfogatot 4 literre emeljük, és a vizes frakciót négyszer megosztottuk azonos térfogatú (4 liter) etil-acetáttal. Az etil-acetátos rétegeket egyesítjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A megmaradt szilárd anyagokat a gömblombikból víz és etanol keverékével újraszuszpendáljuk, és az oldatot fagyasztva szárítjuk, így stabil port kapunk, amelyet meghatározott koncentrációra hígíthatunk a tesztelés céljából.

Sejtkultúra, transzfekció és luciferáz vizsgálatok

Humán U2OS osteosarcoma, MCF-7 emlőrák és ECC-1 endometrium rákos sejtvonalakat az American Type Culture Collection-től (Manassas, VA) szereztünk be. A doxiciklin által indukálható ERα cDNS-t expresszáló U2OS sejteket korábban leírtak [39]. Az összes sejtvonalat fenntartottuk és szubkultúráztuk az előzőekben leírtak szerint [40]. A transzfekciókat Bio-Rad gén pulzálóval hajtottuk végre, amint azt korábban leírtuk [40]. Röviden: az U2OS sejteket 3 ug ERE és NKG2E tk-luciferáz (tk-Luc) riportervektorral és 1 ug ERα expressziós vektorral elektroporáltuk. Az ECC-1 sejteket 3 ug ERE tk-Luc-tal elektroporáltuk. Elektroporáció után a sejteket szélesztjük és E2-vel, RG-vel vagy RP-vel kezeljük 18 órán át. A sejteket ezután szolubilizáltuk, és a luciferáz aktivitást meghatározó készlet segítségével meghatároztuk (Promega, Madison, WI). A kísérleteket legalább háromszor hajtottuk végre, és az átlag ± S.E.M. kiszámolták.

ERα kötési vizsgálat

Az ERα-hoz való kötődést fluoreszcencia polarizáción alapuló ER versenytárs-tesztekkel határoztuk meg a gyártó protokollja szerint (Invitrogen, Carlsbad, CA). A 2X Fluormone ™ ES2/ERα komplexet hozzáadtuk az RG és RP hígítási soraihoz, hogy versenygörbéket hozzunk létre. A polarizációt az RG és RP koncentrációjának függvényében ábrázoltuk. Az RG és RP koncentrációja, amely a polarizáció felének maximális eltolódását eredményezi, megegyezik az IC50 értékkel.

Xenograft vizsgálatok meztelen egereken

Az MCF-7 sejteket DMEM/F-12 táptalajban növesztettük, amely 4% meztelen szarvasmarha-magzati szérumot tartalmazott, és szuszpendáltuk steril PBS∶Matrigelben (1-1). MCF7 sejteket (250 000 sejt) injektáltunk a 8 hetes CD-1 meztelen egerek (Charles River, Wilmington, MA) emlőzsír-párnájába (MG # 4; mindkét oldal). Az egereket véletlenszerűen választottuk el tíz csoportban. A kontroll egereket vivőanyaggal kezeltük. Az E2-vel kezelt egerek 0,25 mg E2-t tartalmazó szubkután mini pumpát (Alzet, Cupertino, CA) kaptak. Nyolc csoportot kezeltek orálisan, naponta, hetente ötször, 4 héten keresztül, 40, 80, 160 vagy 320 mg/nap RG-vel vagy RP-vel külön-külön. A daganat méretét 4 hét múlva mértük. Az állatprotokollokat a Bionovo Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság hagyta jóvá. Valamennyi állatkísérletet szigorúan az Országos Egészségügyi Intézet laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatójában foglalt ajánlásoknak megfelelően végezték el.

Súlyvizsgálatok egereken

A testtömeg növelése érdekében huszon tíz hetes, petefészekektől eltávolított C57Bl/6 nőstény egereket (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 7 hétig tápláltunk magas zsírtartalmú étrenddel (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ). Hízás után az egereket véletlenszerűen elválasztották négy, öt egérből álló csoportban. Két csoportot kezeltek orálisan, hetente ötször, 6 héten át 80 mg RG-vel vagy RP-vel, miközben HFD-n tartották őket. A kontroll egereket folyamatos infúzióval kezeltük hordozót tartalmazó ozmotikus Alzet pumpákkal. Az E2-vel kezelt egerek 0,25 mg E2-t tartalmazó vivőanyagot tartalmazó pumpákat kaptak. A testtömeget hetente regisztráltuk. A kísérlet végén # 4 emlőmirigyet gyűjtöttünk és lemértünk. Mindegyik pár egyik mirigyét előkészítettük egész tartókra, a másikat szövettani és RNS-extrakcióra. A hasi zsírraktárakat is összegyűjtöttük, lemértük és kivontuk RNS-re. Végül a méhet összegyűjtöttük, lemértük, és RNS kivonásra használtuk. A kísérletet reprodukáltuk, és hasonló eredményeket adott. A bemutatott adatok mindkét kísérletre reprezentatívak.

Az emlőmirigy egész szerelvények

Az emlőmirigy egész tartóit a korábban leírtak szerint készítettük el [41]. Röviden, a # 4 emlőmirigyeket a szubkután szövetektől távolítottuk el, és frissen elkészített Methorn-oldatban (60% metanol, 30% kloroform és 10% ecetsav) 48 órán keresztül rögzítettük, dehidratáltuk, acetonnal 48 órán át fölözöttük, rehidratáltuk és 2 órán át vas-hematoxilinnel festettük a mosás és a Histo-Clear konzerválás előtt (National Diagnostics, Somerville, NJ) a leírtak szerint [41]. Az emlőmirigy teljes tartóit fénymikroszkóppal vizsgáltuk az emlőszerkezetek értékelésére.

Microarrays

A hasi zsírt, a 4. emlőmirigyeket és a méh szöveteit a fent leírt egerekből RNSlater RNS stabilizáló reagensbe (Qiagen) gyűjtöttük. A teljes RNS-t az Aurum teljes RNS zsír- és rostos szövetkészlettel (Bio-Rad, Hercules, CA) izoláltuk a gyártó protokollja szerint. Az RNS-t először standard spektrofotometriával számszerűsítettük, majd minőségileg kapilláris elektroforézissel értékeltük, az Experion rendszert (Bio-Rad, Hercules, CA) felhasználva. Biotinnal jelölt cRNS-mintákat készítettünk 400 ng teljes RNS-templáttal. A szintézist és tisztítást követően a biotinnal jelölt mintákat 260/280 abszorpciós spektrofotometriával és kapilláris elektroforézissel értékeltük. A végső jelölt cRNS-mintákat egy éjszakán át hibridizáltuk MouseWG-6 BeadChip tömbökkel, amelyek több mint 45 200 szondát (Illumina) tartalmaztak, a Kaliforniai Egyetem, a San Francisco Genomics Core.

A nyers intenzitási adatokat az Illumina BeadStudio szoftvercsomag alakította át szöveges fájlokká, majd a BioConductor limma csomag segítségével elemezte. Különösen az adatokat a háttérben korrigálták a Normal + Exponential modell segítségével negatív kontrollok segítségével, majd kvantilis normalizálták. A lineáris modellt illesztettük a limmához, és a p-értékeket moderált t-próba alapján számítottuk ki, és Benjamini-Hochberg korrekcióval többszörös teszteléshez igazítottuk. Módosított p-értékű gének 5′-CCCAGAGAGTATATAAGGACAAGCAAAGG-3 ’; 5'-AGTATGCCATTCCCCATTAATCTTTTCTAC-3 'hátramenet; GPX3 előre 5′-GTGAGCGCGATGGCCGTGTA-3 ′; 5'-ACCACAGACGGGGCTCAGGGG-3 'hátramenet; LCN2 előre 5′-TGGGGGTCCTGCAGAGCCAGG-3 ′; Fordított 5′-CCTGCCCCGGAACTGATCGC-3 '; CD8B előre 5′-ACTTCTGCGCGACGGTTGGG-3 ’; 5'-GGGTGGGGGAACGGGCATTG-3 'hátramenet; CD79B előre 5′-GGAGACAAGCTGCAGCCCAGG-3 ’; 5'-CAACAGCCAGTGGCAGGGCA-3 'hátramenet; LEP előre 5′-GAGCACAAGGAGGGGCCAGC-3 ′; Fordított 5′-CGCAGCGAAGCGTGTACCCA-3 ′.

Eredmények

A növényi kivonatok aktiválják a transzkripciót az ERα-n keresztül

Tizennyolc növényi kivonatot (PE), amelyet történelmileg a menopauzával összefüggő állapotok kezelésére használtak [43], az ERα aktivitást szkrínelték azáltal, hogy az U2OS sejteket transzfektáltuk a luciferáz riporter génhez (ERE) kapcsolt minimális timidin kináz promótert megelőző klasszikus ösztrogénre reagáló elemmel (ERE). tk-Luc) és egy humán ERα expressziós vektorát. Ezen képernyők alapján választottunk ki PE-ket a Radix Glycyrrhiza uralensis (RG) és a Radix Pueraria montana var. lobata (RP) további vizsgálatokhoz, mert az ERE tk-Luc ERα-mediált aktivációját mutatták ki.

A klasszikus ERE mellett az RG és RP ERα aktivitását egy NKG2E promóterből származó összetettebb ERα reagáló szabályozó elem segítségével vizsgálták, amely a c-jun, a hősokk-faktor 2 és a CCAAT/enhancer-kötődés közötti együttműködést igényli. fehérje béta és egy ERE variáns az E2 teljes aktiválásához [44]. Az RG és RP kevésbé voltak aktívak, mint az E2 az ER2 expressziós vektorával transzfektált U2OS osteosarcoma sejtekben [39], de az ERE (1A. Ábra) és az NKG2E (1B ábra) tk-Luc riporterek jelentős aktivációját eredményezték. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az RG és az RP különböző típusú ösztrogén válasz elemekkel rendelkezik ERα aktivitással.