Plazmatikusan magasabb homocisztein szint alkoholmentes zsírmájbetegségben (NAFLD)

Absztrakt

Háttér

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD) krónikus májbetegség, amely magában foglalja a máj patológiájának spektrumát, például egyszerű steatosis, steatohepatitis, fibrózis és cirrhosis. A homocisztein (Hcy) megemelkedett szérumszintje összefüggésben lehet a máj zsírfelhalmozódásával. A folát útján végzett genetikai mutációk csak enyhén károsíthatják a Hcy anyagcserét. A vizsgálat célja a máj steatosis és a plazma homocisztein szint, valamint az MTHFR C677T és A1298C polimorfizmusok kapcsolatának vizsgálata volt NAFLD-vel rendelkező brazil betegeknél.

Mód

Harmincöt beteget, máj-biopsziával diagnosztizáltak NAFLD-vel, és negyvenöt egészséges kontrollt, életkoruk és nemük szerint sem, genotipizáltuk C677T és A1298C MTHFR polimorfizmusokat PCR-RFLP és PCR-ASA alkalmazásával, és Hcy-t HPLC-vel határoztuk meg. Valamennyi beteg negatív volt a Wilson, a hemochromatosis és az autoimmun betegségek markerei szempontjából. Napi alkoholfogyasztásuk kevesebb volt, mint 100 g/hét. A májbiopsziák idején metabolikus és szérum lipidmarkerek készletét is mértük.

Eredmények

A plazma Hcy szint magasabb volt a NAFLD betegeknél a kontroll csoporthoz képest (p = 0,0341). Nem figyeltek meg statisztikai különbséget a 677C/T (p = 0,110) és az 1298A/C (p = 0,343) genotípusoknál a NAFLD-ben és a kontroll alanyokban. A genotípusok eloszlása Hardy-Weinberg egyensúlyban volt (677C/T p = 0,694 és 1298 A/C p = 0,188). A betegek és a kontrollcsoport statisztikailag szignifikáns különbséget mutatott (p 0,05). Az MTHFR C677T és A1298C iránti genetikai érzékenységet nagy populációalapú vizsgálatokban kell megerősíteni.

Háttér

A nem alkoholos zsírmájbetegség (NAFLD) egy krónikus májbetegség, amely a máj patológiájának spektrumát tartalmazza, beleértve az egyszerű steatosist, a steatohepatitist (NASH), a fibrózist és a cirrhosist [1]. A NALFD ma a leggyakoribb oka a kóros májbiokémiának Észak-Amerikában. A trigliceridek májban történő felhalmozódását a túlzott alkoholfogyasztás hiányában a hatvanas évek elején írták le [4], és főként macrovesicularis máj steatosis jellemezte [5].

A két anyagcsere-rendellenesség, amely többnyire a NAFLD-hez kapcsolódik, az inzulinrezisztencia (IR) és a máj zsírsav-ellátásának fokozódása [6, 7]. Amint a zsírszövet rezisztenssé válik az inzulinnal szemben, a szérum lipoprotein szintje elmozdul, és a szabad zsírsavak májbaáramlása megnő [8, 9]. Az inzulinrezisztencia és a megnövekedett keringő szabad zsírsavak kumulatív hatása együttesen hat a zsírsavak raktározásba, nem pedig szekréciós és lebomlási útvonalakra [10, 11]. Ezért főleg az IR egyéb klinikai megnyilvánulásaihoz kapcsolódik, például a metabolikus szindrómához és annak jellemzőihez, például elhízáshoz, 2-es típusú cukorbetegséghez, diszlipidémiához és magas vérnyomáshoz [12].

Ezenkívül beszámoltak arról, hogy a hiperhomociszteinémia (HHcy) megváltoztatja az intracelluláris lipid anyagcserét [13]. Így az adatok alátámasztják azt a nézetet, hogy a homocisztein (Hcy) megemelkedett szérumszintje összefüggésben lehet a máj zsírfelhalmozódásával. A homocisztein kéntartalmú aminosav, amely köztes termék a metionin és a cisztein aminosavak normál bioszintézisében [14].

A folát útvonalon található egyes genetikai mutációk enyhén károsíthatják a homocisztein anyagcserét [4, 15]. A genomi DNS metilációja közvetlenül korrelál a folát állapotával és fordítva, a plazma homocisztein szintjével. A metilén-tetrahidrofolát-reduktáz (MTHFR) polimorfizmusok befolyásolják a DNS metilációs állapotát a folát státusszal való kölcsönhatás révén [15]. Mutációk MTHFR gén (C677T és A1298C) aminosav-szubsztitúciókat eredményez, amelyek csökkent enzimaktivitáshoz vezetnek, csökkentve az 5 mTHF elérhetőségét [16]. A MTHFR Kimutatták, hogy a C677T és A1298C polimorfizmusok magasabb homocisztein szinttel társulnak, amikor a plazma folát szintje alacsony [16, 17].

Számos vizsgálatot végeztek annak érdekében, hogy kapcsolatot találjanak a MTHFR polimorfizmusok és a betegség kockázata. A C677T és A1298C polimorfizmusok a populáció nagy részét érintik, jelentős eltérésekkel a különböző etnikai csoportok között [18]. Noha Brazília az ország öt földrajzi régiójából származó populációk között megfigyelt fenotípusos és társadalmi különbségek miatt a népességgenetikai vizsgálatok iránti érdeklődés tárgyává vált, MTHFR C677T és A1298C polimorfizmusokra van szükség a brazil populációban, különösen akkor, ha a NAFLD-hez társulnak. Ezért ennek a tanulmánynak a célja a máj steatosis és a plazma homocisztein szint és a MTHFR C677T és A1298C polimorfizmusok Északkelet-Brazíliából származó NAFLD-ben szenvedő betegeknél.

Mód

Ez a vizsgálat 35 beteget vett fel, akiknek májbiopsziás eredményei alapján (09 férfi és 26 nő, életkoruk átlagosan 49 év) diagnosztizálták a NAFLD-t, valamint 51, egészséges NAFLD nélküli egyént (16 férfi és 35 nő, életkoruk átlagosan 39 év) - áll az ultrahang alapján. megállapítások a Pernambuco-i májintézetben (Brazília, 2005-2008 között). Ezenkívül minden betegnél legalább két alkalommal, a beiratkozást megelőző 6 hónapban legalább két alkalommal emelkedett az alanin-aminotranszferáz (ALT) és/vagy az aszpartát-aminotranszferáz (AST) szintje. A vizsgálati protokollt a Pernambucói Egyetem Humán Kutatási Etikai Bizottsága hagyta jóvá, és minden, a vizsgálatban részt vevő egyéntől írásbeli hozzájárulást kaptak. Ezt a transzverzális vizsgálatot a 2008. évi helsinki nyilatkozattal összhangban végezték el.

Valamennyi beteg negatív volt a Wilson-kór, a hemochromatosis és az autoimmun betegségek markereire nézve, és a jelenlegi és korábbi napi alkoholfogyasztás 100 g/hét alatt maradt. Kizárták azokat a betegeket, akik hepatitis B felszíni antigén- és/vagy HIV-pozitívak voltak, és a májbetegség egyéb lehetséges okai voltak. Klinikailag dekompenzált cirrhosisban szenvedő betegek vagy a májbiopszia ellenjavallatai nem kerültek be a vizsgálatba.

Egyik beteg sem szedett steatózist okozó gyógyszert (szalicilátok, nem szteroid gyulladáscsökkentők, kortikoszteroidok, valproinsav, amiodaron, perhexilin-maleát) vagy módosította a homociszteinémia szérumszintjét (folát, B12-vitamin).

A 2-es típusú cukorbetegség és a diszlipidémia diagnosztizálása az American Diabetes Association kritériumain alapult (éhomi glükóz ≥ 100 mg/dl; triglicerid ≥ 150 mg/dl HDL 25 kg/m 2 és elhízás a BMI-nél ≥ 30 kg/m 2 .

Laboratóriumi vizsgálatok

Az éjszakai éhomi étrend után vérmintákat vettünk, és 60 percen belül centrifugáltuk a plazma, a szérum és a leukocita sejtek elválasztására, és - 80 ° C-on tároltuk.

Az éhgyomri glükózt, az összes koleszterint és a frakciókat, a triglicerideket, az alanin-aminotranszferázt (ALT), az aszpartát-aminotranszferázt (AST), az alkalikus foszfatázt (AP), a γGT-t standard módszerekkel, automatizált technikákkal (Modular P800, Hitach/Roche) végeztük minden bazális sorban és a vizsgálat végén.

A homocisztein szinteket HPLC-vel (nagy teljesítményű folyadékkromatográfia) határoztuk meg fluorimetrikus detektálással [20]. A folsavat és a B12-vitamint standard módszerekkel, automatizált technikákkal (Elecsys és COBAS analizátorok/Roche) határoztuk meg.

Az inzulinrezisztencia-indexet az éhomi inzulin és az éhomi glükóz alapján számítottuk ki a homeosztázis modell értékelése (HOMA -IR) szerint [21]. A testtömeg-index (BMI) az egyén testtömegének a magasságának négyzetével elosztva.

Mert MTHFR a polimorfizmus azonosítása, a DNS-t a sózási módszerrel extraháltuk a leukocitákból. A C677T és A1298C MTHFR a polimorfizmusokat PCR-RFLP-vel határoztuk meg (Hinf I), illetve PCR-ASA [22, 23]. Az amplifikált és emésztett fragmenseket 3% -os agarózgélen analizáltuk, és a fragmenseket ultraibolya fényben (UV) tettük láthatóvá, miután etidium-bromiddal festettük. A 677 vad típusú (CC) egyetlen 198 bázispárnyi fragmentumot mutat; a heterozigóta (CT) 198, 175 és 23 bázispár töredékeket mutat; és a mutáns homozigóta (TT) két fragmenst mutat 175 és 23 bázispárral [22]. A polimorfizmus MTHFR Az A1298C vad típusú és mutált allélek 77, illetve 120 bp fragmenseket eredményeznek [23].

Szövettani elemzés

Egyetlen májpatológus értékelte az összes NAFLD-ben jártas példányt: makro és mikrovacuoláris zsírváltozás, zonális eloszlás, nekrózis gócai, portális és perivenuláris fibrózis, gyulladásos és fibrotikus infiltrátum zónás eloszlással. A makrovezikuláris steatózist alacsony steatosisban osztályozták (66%) [24].

Statisztikai analízis

Az adatok elemzését a BioEstat 5.0 szoftverrel végeztük. A kvantitatív változókat átlag ± SD értékekkel írták le. T-teszt és Mann – Whitney U tesztet használtunk normál és normál eloszlás nélküli változókban. Spearman's r együtthatót használtunk a folyamatos változók (folát- és B12-vitamin-állapot és homocisztein) közötti összefüggés feltárására. Az egyes allélok gyakoriságát q = (2a + b)/n, ahol a megfelelt a homozigóták számának, b a heterozigóták számához, és n az elemzett allélok számához, ill. Hardy-Weinberg egyensúlyt teszteltünk az SNP szempontjából a megfigyelt frekvenciák és a várható frekvenciák összehasonlításával, valamint egy χ2 teszt. Az esetek és a kontrollok közötti különbségeket az egyes polimorf helyzetek genotípusaiban Fisher pontos tesztjeivel értékeltük. Minden statisztikai értékelésnél, P

Eredmények

Klinikai és biokémiai elemzés

A klinikai és biokémiai paraméterek eredményeit az 1. táblázat ismerteti. Harmincöt betegnél végeztek klinikai és biokémiai elemzést a vizsgálat során. 25,7% (6/35) férfi és 74,3% (26/35) nő volt. A BMI és a HOMA -IR magasabb volt a NAFLD betegeknél, mint a kontroll csoportokban (p 1. táblázat Klinikai és biokémiai jellemzők NAFLD betegeknél és kontroll személyeknél

A 2. táblázat a B12-vitaminszint eredményeit mutatja, amelyek szignifikáns különbséget mutatnak a betegek és a kontrollok között. Ezenkívül, amikor a NALFD betegeket összehasonlítottuk a kontrollokkal a Hcy szinttel kapcsolatban, szignifikáns különbséget mutattunk ki e csoportok között (p = 0,0341).

Polimorfizmusok elemzése

A MTHFR a polimorfizmusokat 35 beteg és 45 kontroll perifériás véréből elemeztük. A frekvenciák MTHFR A C677T és A1298C lokuszok genotípusait és a megfelelő allélokat a 3. táblázat mutatja. MTHFR a genotípusok megfelelnek a Hardy-Weinberg egyensúly által várt elvárásoknak mind a NAFLD, mind a kontroll betegeknél, jelezve, hogy az alléleloszlás véletlenszerű volt. A CT (48,57%) és az AA (57,15%) genotípusok gyakoribbak voltak a NAFLD-ben szenvedő betegeknél a C677T és az A1298C esetében. Bár a 677TT homozigóta gyakorisága magasabb volt a betegeknél (17,14%), mint a kontrollokban (677TT = 4,44%), a várakozásoknak megfelelően a genotípusok eloszlásának különbsége nem volt szignifikáns (p = 0,110). Statisztikai különbségeket nem tapasztaltunk az A1298C genotípusokban és az allélokban sem (p = 0,343). Nincs különbség a C677T (o = 0,110) és A1298C (o = 0,343) MTHFR polimorfizmus eloszlást találtunk a betegek és a kontrollok között (3. táblázat).

Vita

Vizsgálatunkat azon hipotézis alapján terveztük meg, hogy mindkét polimorfizmus, a C677T és az A1298C homozigozitása jelentősen megemeli a plazma Hcy szintjét. Azonban a MTHFR A C677T és A1298C polimorfizmusok nem különböztek szignifikánsan csoportok között ebben a vizsgálatban. Ez a tény két okkal magyarázható: (1) a minta nagysága kicsi, és (2) a keveredés a régióban történt, mivel az északkelet-brazil populáció afrikai, kaukázusi és őslakos amerikai ősöktől származott [25]. Volcik et al. (2001) a 677 T és A1298C allélok gyakorisága földrajzi területtől és etnikai csoporttól függően változhat, és a populációk között megfigyelt értékkülönbség etnikai különbségekkel és táplálkozással magyarázható [26]. Eredményeink azt mutatták, hogy a mintánkban szereplő NAFLD-vel rendelkező északkelet-brazil betegek kis száma ellenére a NAFLD a megemelkedett Hcy plazmával járt.

Egyesületi tanulmányok MTHFR génpolimorfizmusok és NAFLD-kór, például Serin (2006) és Sazci (2008) által idézett, ritkák. Mindkét tanulmány a török lakossággal készült [3, 27]. Vizsgálatunk a C677T és A1298T első leírása MTHFR polimorfizmus az északkeleti brazilok NAFLD-vel rendelkező mintájában.

Ez a tanulmány azt mutatja, hogy a plazma Hcy magasabb volt NAFLD-ben szenvedő betegeknél, mint egészséges egyéneknél, de ez a tanulmány nem enged következtetni arra, hogy a plazma Hcy növekedése okozza-e az inzulinrezisztenciát, és hogy a plazma Hcy koncentrációja korrelál-e a a betegség stádiuma a NAFLD-ben.

Következtetés

Összefoglalva: az eredmények azt mutatták, hogy Brazília északkeleti részéről érkező betegeknél a NAFLD a megemelkedett plazma Hcy-vel társul. A NAFLD nyilvánvalóan más ismert gazda tulajdonságokkal volt összefüggésben, mint például a BMI, a HOMA és a szérum lipidszintek. Nagyobb mintákkal további vizsgálatokat kell végezni az itt talált összefüggések megerősítésére vagy kizárására, valamint a MTHFR C677T és A1298C polimorfizmus frekvenciák.