Redox homeosztázis a gyomor közegében élelmiszerek által: Az étkezés utáni oxidatív stressz index (POSI) a táplálkozás és az emberi egészség kiegyensúlyozására

Joseph Kanner

Élelmiszertudományi Tanszék, ARO Volcani Center, Bet-Dagan, Izrael

b Biokémiai, Élelmiszertudományi és Táplálkozástudományi Intézet, Mezőgazdasági Élelmiszer- és Környezetvédelmi Kar, Jeruzsálemi Héber Egyetem, Rehovot, Izrael

Jacob Selhub

c Vitamin anyagcsere és öregedés, Jean Mayer USDA a Tufts University-n, Boston, MA, USA

Adi Shpaizer

b Biokémiai, Élelmiszertudományi és Táplálkozástudományi Intézet, Mezőgazdasági Élelmiszer- és Környezetvédelmi Kar, Jeruzsálemi Héber Egyetem, Rehovot, Izrael

Borisz Rabkin

Élelmiszertudományi Tanszék, ARO Volcani Center, Bet-Dagan, Izrael

Inbal Shacham

Élelmiszertudományi Tanszék, ARO Volcani Center, Bet-Dagan, Izrael

Oren Tirosh

b Biokémiai, Élelmiszertudományi és Táplálkozástudományi Intézet, Mezőgazdasági Élelmiszer- és Környezetvédelmi Kar, Jeruzsálemi Héber Egyetem, Rehovot, Izrael

Absztrakt

Grafikai absztrakt

1. Bemutatkozás

Az étkezés utáni oxidatív stresszt (POS) az jellemzi, hogy a lipidekben gazdag étkezés elfogyasztása után megnő a szervezet érzékenysége az oxidatív károsodásokra. A magas zsírtartalmú étrend által érintett POS-t általában átmeneti endotheliális diszfunkció, gyulladás és sejtes oxidatív stressz kíséri, amelyek a CVD fontos rizikófaktoraként szerepelnek [1], [2], [3]. Számos epidemiológiai tanulmány, valamint kísérleti adatok szerint a nyugati mintázatú étrenden élő népesség, magas zsírtartalmú vörös hús, feldolgozott hús, sült ételek, finomított gabonafélék, de alacsony gyümölcs- és zöldségfélék fogyasztása mellett nagy a kockázata szív- és érrendszeri betegségek (CVD), cukorbetegség, vastagbélrák és más degeneratív betegségek kialakulásához [4], [5], [6], [7], [8].

A módosított LDL vagy az MDA-LDL kulcsfontosságú tényezőnek tekinthető az érelmeszesedés megindulásában és felgyorsulásában [16], mint a koszorúér-betegség súlyosságának markerei [17] és más szív- és érrendszeri betegségek [18], [19]. A gyomor bioreaktor képességének felmérésére az élelmiszer lipidek további peroxidációja érdekében randomizált keresztezett vizsgálatot dolgoztunk ki emberen, amelynek során pulykavörös húsból álló ételt adtak önkénteseknek, és meghatározták a plazma és a vizelet MDA szintjét. A húsdarabok elfogyasztása után a plazma MDA szintje emelkedett, és az étkezés utáni LDL módosulását okozta MDA-LDL értékre. Megállapították, hogy az LDL MDA általi módosítása közvetlenül függ az étkezés utáni plazma MDA-szint növekedésétől [8], [20], [21]. AGE-ket tartalmazó elfogyasztott étkezésből reaktív karbonilok felszívódását találták az embereknél is [9], [22]. A kiválasztott népszerű ételek életkorának nagy része azonban húsból és zsírtartalmúakból származik [9].

A szimulált gyomornedv-vizsgálat (SGF) egy bevett módszer, amely utánozza a gyomor állapotát [8], [19], [20] a különböző húsok lipidperoxidációjának mértékének meghatározására az MDA felszabadulása alapján. Ennek a rendszernek a validálásához olyan vizsgálatokat végeztünk, amelyek összehasonlították a lipidperoxidációt ilyen körülmények között az MDA megjelenésével az emberi vérben ugyanazon húsok fogyasztása után. Az eredmények nagyon magas korrelációt mutattak (R 2 = 0,913) az MDA koncentrációi között, amelyek gyomor SGF körülmények között keletkeztek, és a MDA koncentrációja között a vérben, önkéntesekkel különféle ételkombinációk esetén [21], [33], [34].

Ennek a tanulmánynak a célja az volt, hogy meghatározza a különféle ételek (gyümölcsök, zöldségek, italok és fűszerek) redukáló képességét a lipid peroxidáció gátlására a gyomor közegében egy nagyon aktív prooxidáns ételekkel (vörös pulykahús), és kiszámolja az étkezés utáni ételt. Oxidatív stressz index (POSI), amely segíthet az étrend értékelésében az emberi egészség javítása érdekében.

2. Anyag és módszerek

2.1. Vegyszerek

Friss hús (pulyka, csirke és marhahús), fagyasztott hal (tonhal, lazac, laposhal és tilápia), finomított olívaolaj (ROO), amely 16 mg/L polifenolt tartalmaz, (BORGES, Spanyolország), ω – 3 kiegészítő halolaj „Alsepa MAX ”(Ocean-Nutrition, Kanada) helyi boltokból szerezték be. Metmioglobint (metMb, ló vázizomzatából), ß-karotint, Tween 20-at, butilezett hidroxitoluolt (BHT), katechint, pepszint (A sertés gyomornyálkahártyájából), vas-ammónium-szulfátot, xilenol-narancsot és trifenil-foszfint (TPP) nyertünk Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Nátrium-kloridot, hidrogén-peroxidot (30%) és l-aszkorbinsavat (AA) a Merck-től (Darmstadt, Németország) nyertünk. Vas-kloridot (Fe) Riedel-de-Haen-től (Hannover, Németország) nyertünk. A nátrium-borohidrid a BDH-tól (Poole, Dorset, Anglia) származott. Az oldószerek mindegyike HPLC minőségű volt (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA). Szójababolajat, vörösbort (izraeli Cabernet Sauvignon) és grillezett pulykahúst (shawarma) vásároltak Izrael kereskedelmi üzleteiben. A szimulált gyomorfolyadékot (SGF) frissen készítették az Egyesült Államok Pharmacopeia-jának (United States Pharmacopeia Inc. Rockville, MD, 2000) megfelelően. Az SGF NaCl-ot (200 mg), pepszint (320 mg) és HCl-t (700 µl, 36%) DDW-ig (100 ml) tartalmazott [35].

2.2. A malondialdehid meghatározása a húsban a szimulált gyomornedvben való inkubálás után (SGF)

A pulykavörös húst, apró szeletek formájában, 1 percig melegítették mikrohullámú sütőben, lehűtötték, részekre osztották és -80 ° C-on tartották a felhasználásáig [32]. Ezt a fagyasztott húst (10 g) 30 ml SGF-fel őröltük 60 másodpercig laboratóriumi turmixgépben (Waring, New Hartford, CT), és pH-ját 3,0-ra állítottuk. A hús-folyadék keveréket (homogenát) minden egyes kezelésnél több csőre osztottuk, és rázófürdőben 37 ° C-on 180 percig inkubáltuk. Négy időpontban (0, 30, 90, 180 perc) a lipidperoxidációt MDA-ként határoztuk meg Kanner és munkatársai által leírt TBA módszerrel. [32] az alábbiak szerint: mindegyik mintát azonnal összekevertük 15% TCA-val 1: 1 arányban, és 10 percig 20 800 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót ezután TBA-val (2,8 mg/ml) kezeltük 1: 1 (v/v) arányban. A mintákat forrásban lévő vízfürdőben 20 percig melegítettük, és 532 nm-en leolvastuk (Synergy HT, BIO-TEK). Az MDA koncentrációt 1 µmol/L = 0,156 abszorbancia alapján számítottuk [36].

2.3. A lipid-hidroperoxidok meghatározása

A lipid-peroxidokat FOX-2 esszével határoztuk meg [33]. A vörös húst a malondialdehidre leírtak szerint kezeltük. 37 ° C-on végzett inkubálás után 1 ml homogenizátumot 9 ml BHT-t (4,4 mM) tartalmazó metanollal elegyítünk a peroxidos extrakcióhoz, majd 14 500 g-on 3,5 percig centrifugáljuk. A felülúszót (100 ul) háromszorosban adtuk a csövekhez, amelyek 10 ul metanolt (vagy metanolt + TPP-t) tartalmaztak, és 25 ° C-on inkubáltuk 30 percig. Inkubálás után FOX-2 reagenst (890 ui), amely BHT-t (4,4 mM) tartalmaz, és további 30 percig inkubáljuk. A mintákat spektrofotométerrel mértük 560 nm-en. A lipid-hidroperoxidokat úgy számítottuk ki, hogy figyelembe vettük a metanol + TPP minták önmagában vett metanoljának eredményeit. A standard görbét tiszta tiszta hidrogén-peroxid alkalmazásával hajtottuk végre. Az olajokban a H2O2 meghatározását FOX-2 reagenssel végezzük katalázzal és anélkül, hogy meghatározzuk a H2O2 jelenlétét. (1000 µM hidroperoxid megegyezik 1 mmol ekvivalens peroxiddal/kg olaj).

2.4. A ß-karotin kooxidációja a hús homogenátumában

A pulyka vöröshúst SGF-ben homogenizálás után 15 µM végkoncentrációban ß-karotinnal kevertük. A ß-karotin törzsoldat vízben történő elkészítését a korábban publikáltak szerint hajtjuk végre. Röviden: 25 mg ß-karotint és 0,9 ml Tween 20-at 25 ml kloroformban oldunk [37]. Az oldatot (1 ml) szárazra pároljuk és 10 ml vízzel oldjuk. A reakciócsöveket kétszer inkubáltuk rázófürdőben 37 ° C-on 90 percig. A reakciót egy térfogat hexán és egy térfogat etanol keverésével állítottuk meg, és az elegyet további 5 percig hagytuk a fázisok elválasztására. A ß-karotint a hexán felső fázissal extraháltuk, és 460 nm-en spektrális analízissel határoztuk meg. A karotinoid-koncentráció kiszámításához 460 nm-en (1%, A = 2550) a hexánban ß-karotin extinkciós együtthatóját használtuk [37].

2.5. A polifenolok meghatározása élelmiszerekben és italokban

Az élelmiszerek polifenol-tartalmát Folin-Ciocalteau reagenssel határoztuk meg, és az egyes élelmiszerek aszkorbát-tartalmának korrekcióját követően katechinegyenértékként számoltuk. Ez utóbbit HPLC-vel határoztuk meg (lásd alább). A bemutatott eredmények a triplikátumok átlagát jelentik, és az ábrákon mindegyik jelzett hiba a szórást jelöli. Az aszkorbinsav, mint hatékony redukálószer, kölcsönhatásba lép a Folin-Ciocalteau reagenssel, és ez befolyásolja az élelmiszer-polifenolok eredményeit. Az aszkorbinsavat használtuk a Folin-Ciocalteau reagenssel végzett standard kalibrálás előállításához. A HPLC módszerrel meghatározott aszkorbinsav mennyiségét normalizáltuk a Folin-Ciocalteau reagensből származó mennyiségével, és csökkentettük a polifenolok esetében elfogadott eredményekből, hogy jobban értékeljük az élelmiszerekben található polifenolok teljes mennyiségét [37].

2.6. C-vitamin mérés

A homogenátum mintákat TCA-val (11,3%) (1: 1 v/v) keverjük és 3 percig 20 800 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót 0,2 µm-es membránon átszűrtük, és 20 µl-es alikvot részt injektáltunk egy HPLC-be (Merck-Hitachi L-6200A), és elválasztottuk Merck Lichrocart RP-18, 125-4 oszlopról, izokratikus mobil fázissal eluálva. KH2PO4 (10 mM): MeOH (97: 3 v/v) és 0,75 mM tetrabutil-ammónium-hidroxid, 1 ml/perc áramlási sebességgel, és diódasoros detektorral (Shimatzu, Kyoto) detektáljuk 268 nm-en. Az aszkorbinsavat (Merck) használták egy standard kalibrációs görbe előállításához [37].

2.7. Növényi anyagok előkészítése a POS indexhez

A friss növényi anyagot apró szeletekre vágtuk

1 cm 3 és azonnal blansírozzuk, 1 percig mikrohullámú sütőben melegítve (Dow, S-Korea, 800 W-on), lehűtve, és vákuumcsomagban -80 ° C-on tartjuk felhasználásig. A növényi anyagot laboratóriumi turmixgépben (Warring, New Hartford, CT) 60 másodpercig homogenizáltuk szimulált gyomornedvvel (1/1 tömeg/térfogat arányban), amelynek pH-ját 3-ra állítottuk. A blansírozást enzimek, különösen polifenol-oxidáz, aszkorbát-oxidáz és általában olyan peroxidázok inaktiválására végezték, amelyek képesek oxidálni a polifenolokat, az aszkorbinsavat és más redukálószereket. Az italokat forró vízzel készítettük az előzőekben leírtak szerint [33], [38].

2.8. Statisztikai analízis

Az eredményeket (átlag ± SD) százalékban vagy tömegben vagy molárisan fejezzük ki. A statisztikai szignifikanciát egyirányú varianciaanalízissel határoztuk meg, Student-Newman-Keuls teszt (SAS szoftver, SAS Institute Inc., Cary, NC) alkalmazásával végzett rangsorolási eljárással. Az eredmények a triplikátumok átlagát jelentik, és az ábrákon minden hibasáv (I) a szórásokat jelöli.

3. Eredmények

3.1. A fokozott étkezés utáni oxidatív stressz index (ePOSI) számításának alapja

A vörös pulykahús (200 g) lipidperoxidációját SGF-ben a TBA-RS kiterjesztésével határoztuk meg, és MDA felhalmozódásként (nmol/g hús) fejeztük ki 37 ° C-on, 180 percig. Ezeket az MDA mennyiségeket (120 ± 6,1 nmol/g hús), amelyet 200 g hús képez 1000 ml SGF-ben vagy ezzel egyenértékű kisebb modellrendszerben, ePOSI = 100 értékkel számoltuk. A vörös pulykahúst, a szárazföldi állatok közötti gyomorközeg lipidperoxidációjának legmagasabb fokozóját [36] választották hús referenciaként a különböző növényi homogenizátumok gátló hatásának kiszámításához. A pulyka vörös húsának SGF-ben és olívaolaj (25 ml) vagy ω-3 olaj (25 ml) jelenlétében ePOSI volt

300, ill. A POSI-t sok étel, de különösen az izomételek befolyásolhatják (1. táblázat).

Asztal 1

A POSI izomtáplálék-fokozói (ePOSI).

Izomeledel MDA nmol/gePOSI/200 g FW

Törökország - comb	120 ± 11,2	100
Pulykamell	29 ± 0,5	24.
Csirke comb	40 ± 0,4	34
Csirkemell	20 ± 0,2	17.
Marhahús - Váll (pH 4,6)	65 ± 0,6	54.
Sertéshús - láb	45 ± 0,4	38
Tonhal	152 ± 7,5	126.
Lazac	122 ± 3,3	102
Laposhal	25 ± 0,5	21
Tilapia	7 ± 0,0	6.
Törökország + olívaolaj	86 ± 2,4	72
Törökország + ω-3	367 ± 6,3	306
Törökország + tonhalolaj	583 ± 3,0	486
Marha + ω-3 (pH 4,6)	139 ± 3,5	116

3.2. A csökkent étkezés utáni oxidatív stressz index (rPOSI) számításának alapja

A csökkent étkezés utáni oxidatív stressz index (rPOSI) a növényi eredetű táplálék grammban való képessége, amely teljesen (100%) gátolja az MDA képződést 200 g pulykahúsból, amelyet SGF-ben inkubáltak 180 percig 37 ° C-on. A lipidperoxidációt az SGF-ben az MDA képződés mértéke határozta meg, amelyet TBA-RS addíciós termékként vagy oxidált ß-karotinként mértünk. Az 1. ábra vörös hús lipidperoxidációját mutatja, mindkét módszerrel áfonyával meghatározva. Az áfonya IC50-értéke 100 g hús lipidperoxidációjának gátlására

2,7 g és 10,8 g 100% -os gátláshoz (IC100). Mivel azonban a legtöbb egyén 200 g húst fogyaszt el étkezésenként, az rPOSI-t ezek alapján számították ki. 200 g hús esetében az IC100 értéke 21,8 g = rPOSI 100. Minden növényi homogenátum mennyisége g-ban az IC100/200 g = rPOSI 100 értékre. A növényi rPOSI közötti különbségek kiértékeléséhez kiszámoltuk az indexet 100 g növényi alapon . Ezzel a számítási módszerrel 100 g áfonya rPOSI értéke (100 g/21,6 g) × 100 = 462. Ugyanazon eljárások alkalmazásával a különféle élelmiszerek rPOSI-t a 2., 3., 4., 5., 5., 6. táblázatban mutatjuk be. .

Az áfonya által gátolt pulyka vörös húsú lipidperoxidáció dózis-válasz görbéje (IC50/100 g), a ß-karotin oxidáció és az MDA felhalmozódás módszereivel, SGF-ben, pH 3,0, 37 ° C, t = 180 perc.