A fehérje-tirozin-kináz és a mitogén-aktivált protein-kináz jelátviteli utak hozzájárulnak a heterofil-közvetített veleszületett immunválasz különbségéhez a broiler két vonala között

Eredeti cikkek

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

Bevezetés

Az elmúlt 15 évben a tanulmányok azt mutatják, hogy a veleszületett immunválasznak alapvető szerepe van abban, hogy utasítást adjon az ebből következő szerzett válaszra (Fearon & Locksley, 1996; Bendelac & Fearon, 1997; Medzhitov & Janeway, Jr, 1997a, 1997b; Parish & O ' Neill, 1997), amely az én nem önmagától való felismerésével kezdődik a gazdasejteken a mintázatfelismerő receptorok (PRR) által felismert kórokozóhoz kapcsolódó molekuláris minták (PAMP) detektálásával (Romagnani, 1992; Fearon & Locksley, 1996; Anderson, 2000; Muzio et al., 2000; Akira, 2001; Akira et al., 2001; Janeway, Jr & Medzhitov, 2002).

Az első sejtek, amelyek a fertőzés helyére vándorolnak, a polimorfonukleáris leukociták (PMN) a veleszületett immunválasz és az azt követő gyulladásos válasz (Hachicha) kritikus elemei et al., 1998; Yamashiro et al., 2001; Kobayashi et al., 2002). A csirkékben a heterofilek az elsődleges PMN, és az emlős neutrofilek madárillesztői, és az invazív mikrobák és idegen részecskék gyors fagocitózisával modulálják az akut veleszületett gazdareakciót, amely aktiválja a jelátviteli mechanizmusokat, oxigén intermedierek termelését, proteolitikus enzimeket és citokineket szabadít fel. kemokinek (Kaiser et al., 2000; Kogut et al., 2001, 2003, 2007; Mannering & Cheers, 2002; Ő et al., 2003). Ezek a vizsgálatok együttesen egyértelműen jelzik a heterofilek jelentős szerepét a fiatal madarak veleszületett immunválaszában és az azt követő védelemben (Kogut et al., 1994).

Anyagok és metódusok

Kísérleti csirkék

A vizsgálatban használt szülő brojlercsirkéket kereskedelmi tenyésztőtől szerezték be. A titoktartás érdekében a vonalakat A és B jelöléssel láttuk el. A megtermékenyített petéket inkubáltuk és kikeltük szokásos körülmények között (nedves és száraz hagymahőmérséklet 32 ° C, illetve 37,5 ° C) (Austic és Nesheim, 1990). Kikeléskor a csirkéket faforgácsokat tartalmazó padlótollakba (8 láb × 8 láb) tették, és kiegészítő hővel látták el. Vizet kaptak, valamint kiegyensúlyozott, gyógyszeres kezelés nélküli kukorica- és szójaliszt-alapú csirkeindító étrendet ad libitum. A számítások szerint a takarmány 23% fehérjét és 3200 kcal metabolizálható energiát/kg étrendet tartalmaz, és minden más tápanyag-adag megfelelt vagy meghaladta a Nemzeti Kutatási Tanács (1994) által megállapított normákat.

Baktériumok

Baromfi - izolátum Salmonella enterica alfaj enterica Az Enteritidis (SE, # 97-11771) szerovarust az Országos Állategészségügyi Szolgáltató Laboratóriumtól (Ames, Iowa, USA) szereztük be, és triptikus szójalevesben (Difco Laboratories, Becton Dickinson Co., Sparks, Maryland, USA) tenyésztettük éjszakán át ° C. Az SE törzsállományt (1 × 10 9 telepképző egység/ml) minden kísérlethez frissen készítettük, az előbb leírtak szerint, és felhasználásig jégen tartottuk (Swaggerty et al., 2003b).

Heterofil izoláció

Heterofileket izoláltunk 150 csirke perifériás véréből vonalon 1 nappal a kikelés után. A vérvétel után heterofileket izoláltak a korábban leírtak szerint (Swaggerty et al., 2003b). Röviden, a csirkékből származó vért dinátrium-etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA) tartalmazó Vacutainer® csövekbe gyűjtöttük (BD Vacutainer, Franklin Lakes, New Jersey, USA), és alaposan összekevertük. Az egyes vonalak vérét és EDTA-ját összegyűjtöttük, 1% metil-cellulózt tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel 1: 1 arányban hígítottuk, majd 40xg 15 percig 4 ° C-on. A felülúszót egy új kúpos csőbe helyeztük, és Ca 2 + -mentes és Mg 2 + -mentes Hank kiegyensúlyozott sóoldatával (1: 1) hígítottuk, szakaszos Histopaque® gradiensekre rétegeltük (fajlagos súly: 1,077 1,119 felett), majd 190 ° C-on centrifugáltuk. ×g 1 órán át 4 ° C-on. A Histopaque® rétegeket összegyűjtöttük, RPMI 1640-gyel (1: 1) mostuk és 485x-es méretben pelletáltukg 15 percig 4 ° C-on. A sejteket ezután friss RPMI 1640-ben szuszpendáltuk, haemocitométerrel megszámoltuk, és RPMI-ben 1x107/ml-re hígítottuk. A heterofil készítmények következetesen 95% -ban tiszták és> 95% életképesek voltak. Minden szövetkultúra-reagens és vegyszer a Sigma Chemical Company-tól (St Louis, Missouri, USA) származik, hacsak másképp nem jelezzük.

Fehérje-tirozin-kináz-vizsgálat

A teljes foszforilált PTK mennyiségét kereskedelmi forgalomban kapható készlet alkalmazásával számszerűsítettük (katalógusszám: PTK101; Sigma). A heterofileket (4x106/ml) RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel kezeltük 1 órán át, 39 ° C-on, rockeren, és a reakciót 100 ul 20% -os perklórsav hozzáadásával leállítottuk. A gén inhibitorral, széles spektrumú PTK gátlóval kezelt további mintákat is felvettük (200 µM) a specifitás kimutatása céljából (Sigma Chemical Co.). A heterofileket pelletáltuk (485xg 15 percig), a felülúszót eldobjuk, és a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk. A mosást követően a felülúszót dekantáltuk és jéghideg lízispuffert (2 ml) adtunk hozzá; a sejteket újra szuszpendáltuk, és 30 percig jégen tartottuk. A lizált sejteket centrifugálással eltávolítottuk (10 000xg 15 percig 4 ° C-on), és a felülúszót összegyűjtöttük és tirozin-kináz pufferben 1: 1 arányban hígítottuk, és a gyártó utasításait követtük. A stop oldat hozzáadása után a lemezt 492 nm-en 5 percen belül leolvassuk (GENios Plus Fluorescence Microplate Reader; TECAN US Inc., Research Triangle Park, Észak-Karolina, USA).

MAPK család (p38, ERK és JNK) immunvizsgálatok

ELISA az AP-1 és NF-κB transzkripciós faktorok aktivációjának mérésére

Kiértékeltük az AP-1 és NF-κB családok transzkripciós faktorait is. Az AP-1 családtagokat, köztük c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD és JunB, kereskedelemben kapható enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) (TransAM AP-1 család transzkripciós faktor assay kit alkalmazásával) mértük.; Aktív motívum, Carlsbad, Kalifornia, USA); Az NF-KB családtagokat, beleértve a p65, p50, p52, c-Rel és RelB, a TransAM NF-KB család transzkripciós faktor vizsgálati készletével (Active Motif) mértük. A minta előkészítése mindkét vizsgálat esetében azonos volt. Röviden, a heterofileket (1 × 107) RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel kezeltük 1 órán át 39 ° C-on, egy rockeren, és a sejteket centrifugálással (2430 xg 5 percig 4 ° C-on), és a megfelelő frissen elkészített lízispufferrel lizáljuk. A lízist 30 percig jégen végeztük, és a mintákat 10 percenként vortexeltük. A lizátumokat 9720 × -en centrifugáltukg 5 percig 4 ° C-on, és a felülúszókat összegyűjtöttük és -70 ° C-on tároltuk a vizsgálat elvégzéséig. Az ELISA-kat a gyártó protokollja szerint végeztük. A stop oldat hozzáadása után az abszorbancia leolvasást 450 nm-en 5 percen belül végeztük (GENios Plus Fluorescence Microplate Reader).

statisztikai elemzések

Csoportonként 150 csirkéből véralvadásgátló vért gyűjtöttünk össze, és heterofileket izoláltunk. Mindegyik vérgyűjtést és heterofil izolálást négy külön napon végeztük (heterofil sejtek soronként összesen 600 csirkéből gyűltek össze). Minden összehasonlítást és statisztikai elemzést a kontrollokkal összehasonlítottunk az egyes vonalak kezelt értékeivel szemben; a sorok között nem történt összehasonlítás. Az átlag átlagát és standard hibáját az összesített adatokból számoltuk. Statisztikai elemzések (Student's t teszt) a Microsoft® Excel 2007 (P A fehérje-tirozin-kináz és a mitogén-aktivált protein-kináz jelátviteli utak hozzájárulnak a heterofil-közvetített veleszületett immunválasz különbségéhez a broiler két vonala között

Online közzététel:

1.ábra. Teljes foszforilált PTK-aktivitás. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és a foszforilezett PTK összes nemzetközi egységét mennyiségileg meghatároztuk egy kereskedelemben kapható ELISA alkalmazásával. Az A vonal kontroll és az SE által stimulált értékek szignifikánsan (P <0,05) magasabbak voltak, mint a B vonalon megfigyelt értékek (* -gal jelezve). A heterofil sejtek széles spektrumú PTK-gátlóval végzett genisteinnel történő kezelése az SE-expozíció előtt a PTK-szintet összehasonlította a kontrollokkal. Jelentős különbségek a kezelések között, amelyet # jelez (P≤ 0,05). A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

MAPK család

Azt is meg akartuk állapítani, hogy vannak-e mérhető különbségek az MAPK szupercsaládos jelátviteli utak komponensei között. A teljes p38, ERK és JNK fehérjéket (pg/ml) mennyiségileg meghatároztuk az A és B csirkék kontroll és SE stimulált heterofiljeiben. A p38 alapszintje magasabb volt (P A fehérje-tirozin-kináz és a mitogén-aktivált protein-kináz jelátviteli útvonalak hozzájárulnak a heterofil-közvetített veleszületett immunválasz különbségéhez a két brojlercsalád között

Online közzététel:

2. ábra. Összes p38 fehérje szint. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és a kereskedelemben kapható ELISA alkalmazásával mennyiségileg meghatároztuk a p38 fehérje szintet (pg/ml). Az A vonal kontroll és az SE által stimulált értékek szignifikánsan (P ≤ 0,05) magasabbak voltak, mint a B vonalon megfigyelt értékek (* -gal jelezve). A heterofil sejtek SB203580-mal, egy specifikus p38 gátlóval történő kezelése az SE-expozíció előtt a kontrollokhoz hasonló szinteket tartott. Jelentős különbségek a kezelések között, amelyet # jelez (P ≤ 0,05). A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

A PTK és a p38 aktivitással összehasonlítva a JNK esetében eltérő mintázatot figyeltünk meg. A JNK alapszintje (pg/ml) magasabb volt (P A fehérje-tirozin-kináz és a mitogén-aktivált protein-kináz jelátviteli útvonalak hozzájárulnak a heterofil-közvetített veleszületett immunválasz különbségéhez a két brojlercsalád között

Online közzététel:

3. ábra. Összes JNK fehérje szint. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és a kereskedelemben kapható ELISA alkalmazásával számszerűsítettük a JNK fehérje szintjét (pg/ml). A B vonal kontroll és az SE által stimulált értékek szignifikánsan (P ≤ 0,05) magasabbak voltak, mint az A vonalon megfigyelt értékek (* -gal jelezve). A heterofil sejtek SP600125-sel, egy specifikus JNK-gátlóval végzett kezelése az SE-expozíció előtt a kontrollokhoz hasonló szinteket tartott. Jelentős különbségek a kezelések között, amelyet # jelez (P ≤ 0,05). A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

Az ERK szintjét az A és B vonalakból származó kontroll és SE által stimulált heterofil készítményekben mértük (4. ábra). Nem észleltek különbségeket a vonalak között, a kontroll és az stimulált minták között, és a heterofilek PD98059-gyel, ERK-gátlóval történő kezelése a stimuláció előtt szintén nem volt hatással.

Online közzététel:

4. ábra. Összes ERK fehérje szint. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és az ERK fehérje szintjén (pg/ml) mennyiségileg meghatároztuk a kereskedelemben kapható ELISA-t. A kontroll és az SE által stimulált szintek között egyik vonalon sem volt különbség. A heterofil sejtek kezelése PD98059-sel, egy specifikus ERK-gátlóval az SE-expozíció előtt nem volt hatással. A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

Átírási tényezők

Megmértük az AP-1 család transzkripciós faktorainak aktiválódását, beleértve a c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD és JunB értékeket. Mindegyik fehérjét az A és B vonal csirkéiből izolált kontroll és SE-stimulált heterofilekben mértük. Az egyetlen különbséget az A és B vonalak között a c-Jun esetében figyeltük meg (5. ábra). A kontroll szintek összehasonlíthatók voltak a két vonal között, míg a szintek szignifikánsan (P A fehérje-tirozin-kináz és a mitogén-aktivált protein-kináz jelátviteli útvonalak hozzájárulnak a heterofil-közvetített veleszületett immunválasz különbségéhez a két brojlercsalád között

Online közzététel:

5. ábra. Az AP-1 transzkripciós faktor család aktiválása. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD és JunB aktivációt határoztunk meg kereskedelmi forgalomban. -elérhető ELISA. A c-Jun aktivációja szignifikánsan (* P ≤ 0,05) volt magasabb az A vonallal, SE-vel kezelt heterofil sejtekben, míg a B vonal változatlan volt a kontroll szintjétől. Az összes többi aktiválási mintája hasonló volt. Az abszorbancia 450 nm-en volt leolvasva. A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

5. ábra. Az AP-1 transzkripciós faktor család aktiválása. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és kereskedelmi forgalomban meghatároztuk a c-Jun, c-Fos, FosB, Fra-1, JunD és JunB aktivációt. -elérhető ELISA. A c-Jun aktivációja szignifikánsan (* P ≤ 0,05) volt magasabb az A vonallal, SE-vel kezelt heterofil sejtekben, míg a B vonal változatlan volt a kontroll szintjétől. Az összes többi aktiválási mintája hasonló volt. Az abszorbancia 450 nm-en volt leolvasva. A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

Az NF-κB családból származó transzkripciós faktorok, köztük a p50, p52, p65 (RelA), c-Rel és RelB aktiválását szintén mértük az A és B vonalakból izolált kontroll és SE által stimulált heterofilekben (6. ábra). A p50 aktiválása magasabb volt (P A fehérje-tirozin-kináz és a mitogén-aktivált protein-kináz jelátviteli útvonalak hozzájárulnak a heterofil-közvetített veleszületett immunválasz különbségéhez a két brojlercsalád között

Online közzététel:

6. ábra. Az NF-κB transzkripciós faktor család aktiválása. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és p50, p52, p65, c-Rel és RelB aktivációval számszerűsítettük a kereskedelemben kapható ELISA alkalmazásával. A p50 aktivációja szignifikánsan (* P ≤ 0,05) volt magasabb az A sorban SE-vel kezelt heterofil sejtekben, míg a B vonal változatlan volt a kontroll szintjétől. Az összes többi aktiválási mintája hasonló volt. Az abszorbancia 450 nm-en volt leolvasva. A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

6. ábra. Az NF-κB transzkripciós faktor család aktiválása. Heterofileket izoláltunk egynapos csirkékből, RPMI-vel (kontroll) vagy SE-vel stimuláltuk 1 órán át 39 ° C-on, és p50, p52, p65, c-Rel és RelB aktivációval számszerűsítettük a kereskedelemben kapható ELISA alkalmazásával. A p50 aktivációja szignifikánsan (* P ≤ 0,05) volt magasabb az A sorban SE-vel kezelt heterofil sejtekben, míg a B vonal változatlan volt a kontroll szintjétől. Az összes többi aktivációs mintája hasonló volt. Az abszorbancia 450 nm-en volt leolvasva. A bemutatott eredmények négy külön kísérlet átlagát jelentik, a hibasávok pedig az átlag ± standard hiba értékét.

Vita

Ezek az adatok együttesen azt jelzik, hogy az A vonalú csirkék és/vagy heterofiljeik fokozott reagálóképességét részben befolyásolja a PTK-k által, valamint az MAPK szupercsalád specifikus tagjai által közvetített kritikus jelátviteli utak megindításának megnövekedett képessége., ami ezért közvetlenül befolyásolja a hatékony veleszületett immunválasz megindulását és későbbi termelését. Ezen eredmények eredményeként a csirkék szelekciója a specifikus jelátviteli utak fokozott aktiválása érdekében olyan madárvonalat eredményezhet, amely ellenállóbb és jobban reagál a kórokozók széles körével szemben, hatékonyabb veleszületett immunválasz alapján. Azok a csirkék, amelyek eredendően ellenállóbbak a baromfival és az élelmiszeren keresztül terjedő kórokozókkal szemben, valószínűleg megnövekedett élhetőséggel rendelkeznek a területen, és csökkenthetik az élelmiszer által közvetített kórokozók szintjét, ezáltal csökkentve a madárgazdától az élelmiszerellátásba való átvitel lehetőségét.

Köszönetnyilvánítás

A szerzők köszönetet mondanak Laura Ripley-nek és az ifjabb M. Reiley Street-nek a technikai segítségért és/vagy az állatok gondozásában nyújtott segítségért. A kísérleteket az USDA Állattenyésztési Bizottság által megállapított irányelvek szerint végezték. A kereskedelmi termékek említése kizárólag konkrét információk nyújtására szolgál; nem az USDA ajánlása vagy jóváhagyása céljából.