Testtömeg-homeosztát, amely patkányokban és egerekben szabályozza a zsír tömegét a leptintől függetlenül

Közreműködött: Jan-Åke Gustafsson, 2017. november 8. (felülvizsgálatra elküldve: 2017. szeptember 7.; felülvizsgálta: Wolfgang Langhans és Subburaman Mohan)

Ennek a cikknek van egy levele. Lásd:

Kapcsolódó tartalom megtekintése:

Jelentőség

Az egyetlen ismert zsírtömeg homeosztatikus szabályozó a leptin rendszer. Feltételeztük, hogy létezik egy második homeosztát, amely szabályozza a testtömeget, és hatással van a zsírtömegre. Ebben a tanulmányban hozzáadtuk és eltávolítottuk a kísérleti állatok súlyterhelését, és megmértük a biológiai testtömegre gyakorolt ​​hatásokat. Az eredmények azt mutatják, hogy létezik olyan testtömeg-homeosztát, amely a zsír tömegét a leptintől függetlenül szabályozza. Mivel a megnövekedett terhelés testsúlycsökkentő hatása az oszteocitáktól függött, azt javasoljuk, hogy az alsó végtagok hosszú csontjaiban legyen egy testtömeg-érzékelő, amely „testmérlegként” működik. Ez része a testtömeg-homeosztátnak, a „gravitosztátnak”, amely állandóan tartja a testtömeget és a testzsírtömeget.

Absztrakt

Azok az alanyok, akik sok időt töltenek ülve, megnövelték az elhízás kockázatát, de az állás elhízás elleni hatásának mechanizmusa nem ismert. Feltételeztük, hogy a testtömeg homeosztatikus szabályozással rendelkezik. Bemutatjuk, hogy a rágcsálók megnövekedett terhelése, különböző súlyú kapszulák alkalmazásával érhető el a hasba vagy az iv. a hátsó részén visszafordíthatóan csökken a biológiai testtömeg a csökkent táplálékbevitel révén. Fontos, hogy a terhelés enyhíti az étrend okozta elhízást és javítja a glükóz toleranciát. Az azonosított testtömeg-homeosztát a zsíreredetű leptintől függetlenül szabályozza a testzsírtömeget, és két független negatív visszacsatolási rendszert tár fel a zsírtömeg-szabályozás érdekében. Ismeretes, hogy az oszteociták érzékelik a csontörzs változását. Ebben a vizsgálatban a fokozott terhelés testtömeg-csökkentő hatása elveszett az oszteocitáktól kimerült egereknél. Javasoljuk, hogy a megnövekedett testtömeg aktiválja az érzékelőt, amely a súlyt viselő csontok oszteocitáitól függ. Ez afferens jelet vált ki, ami csökkenti a testtömeget. Ezek az eredmények egy leptin-független testtömeg-homeosztátot („gravitostat”) mutatnak be, amely szabályozza a zsírtömeget.

Epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják, hogy az alanyok, akik sok időt töltenek ülve, fokozzák az elhízás, a cukorbetegség és a szív- és érrendszeri betegségek kockázatát. Még epidemiológiai bizonyítékok is vannak az ülési idő és az általános halálozás összefüggésére (1, 2). Az állás elhízás elleni hatásának mechanizmusa lényegében ismeretlen. Valószínű, hogy a magas ülési idő kardiometabolikus fenotípusokra gyakorolt ​​hatásának egy részét az ezzel járó alacsony testmozgás okozza. Egyes cikkek eredményei azonban azt mutatják, hogy a mozgásszegény viselkedés - a sok ülési idő tükrében - összefüggése a metabolikus szindrómával független a fizikai aktivitástól (3, 4). Feltételeztük, hogy az alsó végtagokban van egy homeosztát (5), amely szabályozza a testsúlyt, és hatással van a zsírtömegre. Egy ilyen homeosztát (a leptinnel együtt) elegendő teljes test energiaraktárt biztosítana, de mégis megóvja a szárazföldön élő állatokat attól, hogy túlságosan megnehezedjenek. A testtömeg ilyen homeosztatikus szabályozásának előfeltétele, hogy az integrációs központ, amely lehet az agyban, afferens információkat kapjon egy testtömeg-érzékelőtől. Ezt követően az integrációs központ egy effektorra hatva állíthatja be a testtömeget (6).

Eredmények

Testtömeg-érzékelés a zsír tömeges homeosztázisra egerekben, diéta okozta elhízással.

Leptin-független testtömeg-érzékelés a zsírtömeg homeosztázisához. (A) A megnövekedett terhelés hatása a testsúly változására leptinhiányos Ob/Ob egerekben (kontroll n = 7 és terhelés n = 10). A kombinált terhelés és a leptin-kezelés (1,5 µg/g testtömeg-adag naponta kétszer) hatása a (B) biológiai testtömeg-változásra, (C) -zsírtömeg és (D) izomtömegre egerekben (n = 10). Az adatokat átlag ± SEM * P ⇓ –12) -ben fejezzük ki. Ezért feltételeztük, hogy a krónikus statikus, mérsékelten megnövekedett csontterhelés, amelyet a megnövekedett testtömeg indukál, szintén aktiválja az oszteocitákat, és ezáltal a szisztémás jel révén csökkenti a zsírtömeget. Az oszteociták szerepének meghatározásához a testtömeg megnövekedett terheléssel történő elnyomásában létrehoztunk egy oszteocita kimerült transzgénikus egér modellt diftéria toxin által vezérelt sejtek kimerülésével, specifikusan a DMP1 pozitív oszteociták alkalmazásával (S2. Ábra). Az intakt oszteocitákkal rendelkező egereknél megfigyelt megnövekedett terheléssel a testtömeg normális elnyomása (3A. Ábra) elveszett az oszteocita-szegény egerekben (3B. Ábra). A megnövekedett terhelés csökkentette a WAT ​​(3C. Ábra) és a szérum leptinszint (3D ábra) súlyát az egerekben, amelyekben ép osteocyta volt, de az osteocyta-mentes egerekben nem, míg a csontvázizom súlyában nem volt szignifikáns különbség a csoportok között (ábra 3E). Ezek a megállapítások azt mutatják, hogy a testtömeg terhelés általi elnyomása az oszteocitáktól függ. Javasoljuk, hogy a megnövekedett testtömeg aktiválja az érzékelőt a súlyt viselő csontok oszteocitáitól függően. Ez afferens jelet vált ki az ételfogyasztás csökkentése érdekében (3F ábra).

A testtömeg és a zsírtömeg terheléssel történő elnyomása az oszteocitáktól függ. A megnövekedett terhelés hatása a biológiai testtömeg változására intakt oszteocitákkal rendelkező kontroll nőstény egerekben (kontroll n = 11 és terhelés n = 12), valamint (B) oszteocita-mentes (OCyD) nőstény egerekben (n = 9). A kontroll egerek intakt oszteocitákkal és OCyD egerekkel történő terhelésének hatása (C) zsírtömegre, (D) szérum leptinszintre és (E) izomtömegre, a terhelés megkezdése után 21 nappal mérve. Az adatokat átlagként ± SEM * P ⇓ –23) fejezzük ki. Ezek az adatok alátámasztják azt a következtetést, hogy a zsírtömeg leptin-független szabályozása létezik, de nem nyújtanak információt a lehetséges mechanizmusról. A jelenlegi adatok, amelyek azt jelzik, hogy a terhelés szabályozhatja a zsírtömeget, felveti annak lehetőségét, hogy a leptinhiányos egerekben a lipectomia után megfigyelt zsírtömeg-növekedés a csökkent terhelésnek tudható be. A megnövekedett terhelés csökkentette a biológiai testsúlyt a csökkent táplálékbevitel révén. A normál motoros aktivitás és az a nézet, hogy az egerek egészségesnek tűnnek, azt jelzik, hogy a megnövekedett terhelés hatása az élelmiszer-bevitelre és a testsúlyra specifikus volt.

Megalapozott, hogy a súlyos elhízás megelőzéséhez leptin szignálozás szükséges (7, 24). Az elhízott betegek többségének azonban magas az endogén szérum leptinszintje, és nem reagálnak az exogén leptin kezelésre. Ez azt jelzi, hogy ilyen körülmények között a leptin nem elegendő a zsírtömeg elnyomásához. Ezt leptinrezisztenciának nevezték (7, 25).

Javasoljuk, hogy az optimális zsírtömeg-homeosztázishoz mind a leptinjelzés, mind a testtömeg-érzékelés szükséges. Farmakológiailag mind a testtömeg-érzékelő mechanizmus, mind a leptin-jelátvitel kombinált célzása hasznos lehet az elhízás kezelésében (3F. Ábra). Ennek megfelelően a súlyterhelés és a leptin kezelés additív módon elnyomta a testtömeget a jelen tanulmányban.

A fent leírtak szerint megállapított epidemiológiai kapcsolat van az ülő helyzetben töltött napi órák száma és számos anyagcsere-betegség között, beleértve az elhízást, a cukorbetegséget és a szív- és érrendszeri betegségeket. Ennek oka azonban nem ismert (1, 2). Javasoljuk, hogy a sok ülési idő az oszteociták terhelésének csökkenését eredményezi a súlyt viselő hosszú csontokban, és ezáltal a testtömeg homeosztatikus szabályozása nem aktiválja annak afferens jelét az agy felé, ami elhízást eredményez (3F ábra). Ezenkívül lehetséges, hogy a megnövekedett ülési idő szekuláris tendenciái a testtömeg-érzékelő mechanizmus csökkentett aktiválásával hozzájárulhatnak az elhízás járványához. Az a tény, hogy a terhelés hatékony volt a zsírtömeg csökkentésében mind a Sprague-Dawley patkányokban, mind az étrend által kiváltott elhízással rendelkező C57BL egerekben, a klinikai elhízás jól megalapozott modelljeiben (26, 27), arra utal, hogy a megnövekedett állóidő és ezáltal a megnövekedett terhelés hatékony az emberi elhízás csökkentésében. Ezenkívül eredményeink azt mutatják, hogy a terhelés növeli az inzulinérzékenységet. További vizsgálatokra van szükség annak megvizsgálására, hogy ez a hatás teljes mértékben vagy csak részben a csökkent testzsír-tömeg oka-e.

Anyagok és metódusok

Állatok.

Minden állatkísérletet a Göteborgi Egyetem Állatgondozási és -használati Etikai Bizottsága hagyott jóvá. A C57BL/6 egereket a Taconic cégtől szereztük be, a leptinhiányos Ob/Ob egereket a The Jackson Laboratory cégtől szereztük be, a Ghrelin receptor knockout (GHSR KO) egereket pedig a Deltagen cégtől. Az MC4R KO egereket, a GLP-1R KO egereket és az ERα KO egereket a korábban leírtak szerint fejlesztettük ki (19, 20, 29, 30). Az összes kiütött egér és kontrolljuk C57BL/6 háttéren volt. A Sprague-Dawley patkányokat a Charles River Laboratories-től szereztük be.

Az oszteocita-mentes egerek előállításához a DMP-1 promoter-Cre egereket (31) kereszteztük ROSA26 promoter-Flox-STOP-Flox-DTR egerekkel (32) (S2 ábra). A diftéria toxin receptor (DTR) mRNS-t összehasonlítottuk a kortikális csont, a vese és a máj között RT-PCR-rel (S2C. Ábra). A Sost mRNS-t a kortikális csontban mértük az oszteocita-kimerülés (OCyD) markerként DTR-t expresszáló és diftéria toxint kapott egerekben (S2D ábra).

Immunhisztokémia.

A combcsontban az oszteociták és az üres oszteocita-hiányok számát vakon értékeltük fényes mezőmikroszkóppal. Röviden: a combcsontot rögzítettük, a paraffint beágyazottuk, metszettük és hematoxilinnal és eozinnal festettük. A számláláshoz három egyenletesen elosztott combcsontot használtunk. Az oszteocitákat és az üres hézagokat átlagosan 0,16 mm2-enként számoltuk meg a kérgi csont borításából, és 5 mm-re helyezzük el az epiphysealis lemez csúcsától. Az apoptotikus oszteociták számát TUNEL pozitív festéssel rendelkező sejtként mértük. Röviden, az üres hézagok számlálásához használt metszetekkel szomszédos három combcsontmetszetet festettünk a TUNEL assay-vel (ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit, S7110; Millipore) a kapott utasításokkal összhangban és a DAPI-val ellenfestve. Széles terű fluoreszcens mikroszkóppal (Leica DMRB; Leica Microsystems) olyan képeket készítettek, amelyek szakaszonként átlagosan 0,16 mm2 kérgi csontot fedtek le, és 5 mm-re helyezkedtek el az epiphysealis lemez csúcsától. A háttér autofluoreszcenciáját digitális csatornaszubsztrakciós módszer alkalmazásával csökkentették a képeken. A képeken megszámláltuk a TUNEL pozitív sejteket és a DAPI pozitív sejteket.

Egy külön kísérletben a combcsont szakaszainak kék β-gal festését alkalmazták aktív DMP-1 promoterrel rendelkező sejtek markerjeként. A DMP-1 promoter-Cre egereket vagy a vad típusú egereket kereszteztük ROSA26 promoter-Flox-STOP-Flox-β-gal egerekkel. A kortikális csontban a β-gal festést összehasonlítottuk ROSA26 promoter-Flox-STOP-Flox-β-gal egerek között DMP-1 promoter és Cre nélkül.

Betöltés.

Két-három hónapos egereket és patkányokat 4 hét alatt magas zsírtartalmú étrendet (60% zsír, D12492; Kutatási étrend) tápláltak, majd egy kapszulát, amely a testtömeg (terhelés) 15% -át vagy a a testtömeg (kontroll) intraperitoneálisan vagy sc izoflurán altatásban lévő felnőtt állatokba. Az implantáció után a testtömeget naponta vagy hetente többször megmértük minden kísérlet végéig.

A terhelés eltávolítása egy kísérlet során történt, amelyben a kapszulákat 2 hét múlva cserélték ki az első műtét után, és a teherkapszulával rendelkező egerek fele kapott kontroll kapszulát (terhelés eltávolítása), és fele új terheléses kapszulát (tartós terhelés) kapott 3 hetes követési időszak a terhelés eltávolítása után.

Közvetett kalorimetria, táplálékfelvétel és aktivitásmérés.

Az oxigénfogyasztást és a széndioxid-termelést közvetett kalorimetriával mértük egy INCA Metabolic System (Somedic) rendszerben, a korábban leírtak szerint (33). Az RQ-t az RQ = VCO2/VO2 képlettel számítottuk. A mérést a kapszulák C57BL/6 egerekbe történő beültetése után a 4–6. Napon végeztük, és ugyanebben az időszakban monitoroztuk az élelmiszer-bevitelt mind egerek, mind patkányok esetében. Pár etetési vizsgálatot is végeztünk, amelyben a kontroll egereket ugyanolyan mennyiségű táplálékkal etettük, mint az ad libitum táplált terheléses egereket. A motoros aktivitást automatizált aktivitási kamrákban, úgynevezett Locoboxokban mértük, amelyek műanyag ketrecből (55 × 55 × 22 cm) álltak egy szellőző szekrényben (Kungsbacka Mat-och Reglerteknik AB).

Glükóz tolerancia teszt.

Az orális GTT-t C57BL/6 egereken végeztük 3 héttel a kapszula beültetése után. Az egerek orális glükózt kaptak [2 g/testtömeg-kg (BW); Fresenius Kabi] 5 órás böjt után szondával. Vérmintákat gyűjtöttünk a farokvénából a glükózszonda után 0, 15, 30, 60 és 120 perccel. A vércukor-koncentrációt a fent említett időpontokban határoztuk meg Accu-Check Compact Plus glükométerrel (Roche Diagnostics). A szérum inzulin koncentrációkat a glükóz beadása után 0, 15, 60 és 120 perccel mértük az ultrahangos szenzoros egér inzulin ELISA kit (90080; Chrystal Chem, Inc.) alkalmazásával a gyártó által megadott protokoll szerint.

Leptin kezelés.

A kontroll és a betöltött C57BL/6 egereknek egér leptint (1,5 µg/g testtömeg; Pepro-Tech) vagy sóoldatot kaptunk naponta kétszer s.c. injekciók a kapszula beültetését követő 11–15. napon.

Génkifejezés.

A combcsontból és a sípcsontból származó kérgi csontot, a hipotalamust és az interscapularis BAT-ot boncoltuk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és az elemzésig -80 ° C-on tartottuk. Az agykérgi csontokat TriZol reagenssel (Invitrogen) homogenizáltuk az extrakció előtt. Az összes szövetből származó mRNS-t RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával extraháltuk, és a minták mRNS-koncentrációját NanoDrop spektrofotometriával mértük. A cDNS-t 1 µg mRNS-ből szintetizáltuk iScript cDNS szintézis készlettel (Bio-Rad).

A valós idejű PCR-t a Step-One-Plus vagy az ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) segítségével hajtottuk végre. A hipotalamusz mintákat Universal Taqman Master Mix (Applied Biosystems) segítségével elemeztük egy 48 génes, egyedi gyártású TaqMan kis sűrűségű tömbkártyán, és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázra normalizáltuk (GAPDH, Mm99999915_g1). A kortikális csontmintákat osteocalcin (Mm01741771_g1), szklerosztin (Mm00470479_m1), FGF23 (Mm00445621_m1) és lipocalin 2 (Mm 01324470_m1) és lipocalin 2 (Mm 01324470_m1) vizsgálatokkal elemeztük, és 18S-re (4310893E) normalizáltuk. A BAT mintákat az Ucp1 (Mm0124486_m1) vizsgálatával elemeztük, és 18S-re (4310893E) normalizáltuk. A relatív mRNS-szinteket összehasonlító küszöb-ciklus (Ct) módszerrel kaptuk meg, és a ΔΔCt egyenlettel számoltuk.

Szérum- és vizeletelemzések.

Minden kísérlet végén vérmintákat gyűjtöttünk, és a szérumot elválasztottuk, és az elemzésig -80 ° C-on tartottuk. A szérumot ELISA-kkal párhuzamosan elemeztük leptin (Chrystal Chem, Inc.), szklerosztin (ALPCO immunvizsgálatok), osteocalcin (Immutopics), Gla-osteocalcin és Glu-osteocalcin (Takara Clontech), FGF23 (Kainos Laboratories, Inc.), lipocalin 2 ( K + F rendszerek) és a kolin (Abcam). A szérum tesztoszteront gázkromatográfia-tandem tömegspektrometriás módszerrel elemeztük a korábban leírtak szerint (34). A vizeletmintákat ELISA-val elemeztük noradrenalinra (Labor Diagnostika Nord), és a vizeletet kreatininra (Crystal Chem, Inc.) is elemeztük a noradrenalinszint normalizálása érdekében.

Egy 7T MR rendszert (szoftver: ParaVision 5.1; Bruker BioSpin MRI GmbH) és egy 50 mm-es kvadratúrájú adási/vételi térfogat-tekercset (RAPID Biomedical GmbH) használtunk, hogy külön-külön állati koronaképeket állítsunk elő, és állatok párjainak keresztirányú képeit a terhelési és kontrollcsoportok. A párosítás mindkét csoport számára azonos MRI-jeljavító tulajdonságokat biztosított, megkönnyítve a testzsírtartalom későbbi összehasonlítását.

A koronaképeket 2D-s, többszeletes multi-echo (MSME) szekvencia felhasználásával készítettük, ismétlési idővel (TR) = 1000 ms, visszhangidővel (TE) = 12,3 ms, a jelátlagok számával (NSA) = 2, a szelet vastagságával = 1 mm, látómező (FOV) (olvasás × fázis) = 64 × 28 mm 2, síkbeli felbontás = 160 × 160 mm 2, és a vevő sávszélessége (BW) = 120 kHz. A transzverzális képeket kissé módosított felvételi paraméterekkel (MSME szekvencia: TR = 1000 ms, TE = 9,5 ms, NSA = 45, szeletvastagság = 0,7 mm, FOV = 46 × 35 mm2, síkbeli felbontás = 177 × 177) készítettük. mm 2 és BW = 120 kHz). Mind a koronális, mind a transzverzális képsorozatot kétszer készítettük el, zsírszuppresszióval és anélkül is, és a koronális képeket 177 × 177 mm 2 -re újramintáztuk vizualizáció céljából. A hiperintenzív MR jel régiói (az izomhoz és a szervekhez viszonyítva) egy nem zsír elnyomott képen feltételezhetően zsírt képviselnek, ha a zsír elnyomott kép megfelelő régiója hypointense.

Statisztika.

Az adatokat kétfarkú Student-féle t teszt alkalmazásával elemeztük, feltételezve, hogy a kontroll és a terhelési csoportok, vagy a „tartós terhelés” és a „terhelés eltávolítása” csoportok között egyenlő eltérés mutatkozik. Kétnél több csoport összehasonlításakor az ANOVA-t, amelyet Tukey post hoc tesztje követett. P 1 Kinek lehet címezni a levelezést. E-mail: jojneuro.gu.se vagy jgustafscentral.uh.edu vagy Claes.Ohlssonmedic.gu.se .

amely