A metabolikus szindróma robusztus hatása a szívizom fő metabolikus útjaira

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Maryam Karimi, Vasile I. Pavlov

Szerepek Konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, vizsgálat, projekt adminisztráció, írás - áttekintés és szerkesztés

Rhode Island Kórház, Sebészeti Osztály, Warren Alpert Orvosi Iskola, Brown Egyetem, Providence, RI, Amerikai Egyesült Államok

Egyformán közreműködött ebben a munkában: Maryam Karimi, Vasile I. Pavlov

Társulás Icahn Orvostudományi Egyetem, a Mount Sinai, New York, NY, Amerikai Egyesült Államok

Rhode Island Kórház, Sebészeti Osztály, Warren Alpert Orvosi Iskola, Brown Egyetem, Providence, RI, Amerikai Egyesült Államok

Hovatartozás Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek módszertana, források

Rhode Island Kórház, Sebészeti Osztály, Warren Alpert Orvosi Iskola, Brown Egyetem, Providence, RI, Amerikai Egyesült Államok

Indiana Egyetem, Orvostudományi Kar, Indianapolis, IN, Amerikai Egyesült Államok

Rhode Island Kórház, Sebészeti Osztály, Warren Alpert Orvosi Iskola, Brown Egyetem, Providence, RI, Amerikai Egyesült Államok

Tartozás Los Alamos Nemzeti Laboratórium, Los Alamos, NM, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Pénzügyszerzés, felügyelet, írás - áttekintés és szerkesztés

Rhode Island Kórház, Sebészeti Osztály, Warren Alpert Orvosi Iskola, Brown Egyetem, Providence, RI, Amerikai Egyesült Államok

Maryam Karimi,
Vasile I. Pavlov,
Olivia Ziegler,
Nivedita Sriram,
Se-Young Yoon,
Vahid Agbortoko,
Stoiana Alexandrova,
John Asara,
Frank W. Sellke,
Michael Sturek

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Karimi M, Pavlov VI, Ziegler O, Sriram N, Yoon S-Y, Agbortoko V és mtsai. (2019) A metabolikus szindróma robusztus hatása a szívizom fő metabolikus útjaira. PLoS ONE 14 (12): e0225857. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0225857

Szerkesztő: Cesario Bianchi, Universidade de Mogi das Cruzes, Brazília

Fogadott: 2019. június 21 .; Elfogadott: 2019. november 13 .; Közzétett: 2019. december 2

Adatok elérhetősége: Az adatok a PRJNA544355 csatlakozási számról érhetők el.

Finanszírozás: NIH (R01HL128831 A.U .; R01HL127072-01A1, HL136347-01 - J.F; P30DK097512 - M.S .; Los Alamos National Laboratory LDRD 20180060DR) támogatás a B.S.A. Ez a kutatás a Los Alamos Nemzeti Laboratórium intézményi számítási programjának forrásait használta fel, amelyet az Egyesült Államok Energetikai Minisztériuma Nemzeti Nukleáris Biztonsági Igazgatósága támogat DE-AC52- 06NA25396 számú szerződés alapján.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Rövidítések: MetS, Metabolikus szindróma; LD, Lean Diet kontroll; G6P, glükóz-6-foszfát; F6P, fruktóz-6-foszfát; AcCoA, acetil-koenzim A; Propionil-CoA, propionil-koenzim A; Malonil CoA, Malonil Koenzim A; FBP1, fruktóz-1,6-biszfoszfatáz; G3P, glicerinaldehid-3-foszfát; ATP, adenozin-tri-foszfát; G1P, glükóz-1-foszfát; UDP-GlcNAc, uridin-difoszfát-N-acetil-glükózamin; GlcNAc-1P, N-Ac-glükózamin-1-foszfát; PGAM1, foszfoglicerát-mutáz 1; ENO1, Enolase 1; GAPDH, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz; CPT1A, karnitin-palmitoil-transzferáz 1A; ACAT2, acetil-CoA-acetil-transzferáz 2; FASN, zsírsav-szintáz; ACLY, ATP-citrát-liáz; OXCT1, 3-oxo-sav CoA-transzferáz 1; BDH1, 3-hidroxi-metil-3-metil-glutaril-CoA-liáz; HMGCL, 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-liáz; PYGM, glikogén-foszforiláz; PHKA1, foszforilil-kináz szabályozó alfa 1 alegység; PHKA2, foszforiláz-kináz-szabályozó Alpha 2 alegység; UAP1, UDP-N-acetil-glükózamin-pirofoszforiláz 1; HBP, hexozamin bioszintetikus út; PPP, pentóz-foszfát út; NMF, nem negatív mátrixfaktorizálás; MetS, Metabolikus szindróma; OGA, O-GlcNAcase; LV, bal kamra; WGA, búzacsíra agglutinin; OGT, N-acetil-glükózaminil-transzfreráz; GYG1, glikogén bioszintézis glikogenin1; PAS, Periodikus sav-Schiff

Bevezetés

A metabolikus szindrómát (MetS) a szív patológiájának előfutáraként állapították meg, és összefüggésben állt a szív energia metabolizmusának változásával. Míg az anyagcsere szerepe a szívműködésben az elmúlt 20 évben a genetikai elemzés megjelenésével és népszerűségével beárnyékolt, napjainkban egyre inkább felértékelődik a szívizom energia szubsztrátjainak elérhetőségében szerepet játszó anyagcsere folyamatok, amelyek hozzájárulhatnak a szív patológiájának előrehaladásához.

A MetS az anyagcsere-állapotok csoportja, beleértve az elhízást, a hiperglikémiát, az inzulinrezisztenciát, a hipertrigliceridémiát, a megemelkedett LDL-plazmát, a magas vérnyomást és az endotheliális diszfunkciókat, amelyek a betegeket szívbetegségek és cukorbetegség kockázatának teszik ki [1]. Tekintettel a MetS sokrétűségére, nem valószínű, hogy az egymolekulás biomarkerek vagy a diszreguláció képesek megfelelő módon megragadni vagy előrejelezni a fejlődését [2]. Mint ilyen, a legújabb kutatások nagy mennyiségű metabolit egyidejű szűrésének kvantitatív módszerek alkalmazására összpontosítanak a MetS intracelluláris metabolikus miliőjének jellemzésére.

A vérplazmában lévő poláris metabolitok, főleg egyes aminosavak és származékaik célzott metabolomikai adatait nemrég jelentették elhízott és MetS-ben szenvedő betegeknél [3, 4]. Noha a vér és más testfolyadékok metabolomikai elemzése értékes eredményeket hoz, előnyös a szívizom szöveti változásainak elemzése, tekintettel annak egyedülálló anyagcseréjére. Jelenleg aktívan vizsgálják a metabolikus változások szerepét az emberi szívizomban, bár ezt akadályozza az emberi szövet megszerzésében rejlő nehézségek [5]. Itt a sertés nagyméretű állatmodelljét alkalmazzuk, amely kidolgozza az emberi MetS jellemző ismérveit, hogy leküzdje az emberi és a kis állatmodellek közötti metabolitkezelésbeli eltéréseket és az emberi szövet megszerzésében rejlő nehézségeket. A yorkshire-i sertésekről kimutatták, hogy hiperkalórikus, hiperkoleszterinémiás táplálékkal etetve viszonylag rövid idő alatt kifejlesztik az emberrel közel azonos MetS-t [6, 7].

Itt a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott MetS és a sovány diéta kontroll (LD) Yorkshire sertéseinket alkalmazzuk kombinált kísérleti és felügyelet nélküli nem negatív mátrixfaktoros (NMF) számítási megközelítés alkalmazásával, a szívizomban a MetS azonosságának metabolikus képének megállapításához, egybehangzó metabolomika integráció transzkripcióval és fiziológiai adatokkal. Adataink és elemzéseink összességében képet adnak a szívizom MetS-azonosságáról, és jelentős előrelépést jelentenek a MetS-ben a miokardiális folyamatok beavatkozásának és ellenőrzésének célkitűzéseinek feltárásában.

Eredmények

A hiperkalórikus, hiperkoleszterinémiás étrend hatása a szívizom MetS rizikófaktoraira

Sertésmodellünkben a magas zsírtartalmú étrend által kiváltott MetS összefügg a megváltozott szívizomszerkezettel, a vérnyomással és a szívizom anyagcseréjével (1. ábra). Nyilvántartásba vettük, hogy a hiperkalorikus, hiperkoleszterinémiás étrenden négy sertéstől kapott bal kamrai szövettani szövetszelvények fokozott kollagénlerakódást mutatnak (1A. Ábra, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) és intracelluláris lipidtestek felhalmozódása (1. ábra). 1B; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001), szignifikánsan alacsonyabb glikogén-lerakódással (1C. Ábra; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,001) összehasonlítva a sovány kontroll étrenden lévő sertésekkel ( LD). Amint az 1D. Ábrán látható (n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,001), a MetS sertéseknél szignifikánsan megemelkedett a szisztolés és a diasztolés vérnyomás, valamint a diéta után súlygyarapodás (1E ábra; n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) összehasonlítva az LD állatokkal. A MetS csoportba tartozó állatok a metabolikus szindróma kulcsfontosságú összetevőit fejlesztették ki, beleértve az emelkedett dyslipidaemiát (1F ábra, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001), a plazma LDL-t (1G ábra, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001) és éhomi plazma glükóz (1H ábra, n = 4 MetS, n = 4 LD, p = 0,0001).

A MetS és az LD sertéseket szövettanilag összehasonlítjuk paraffinba ágyazott vagy krio-konzervált szívizom bal kamrai szövetével. Az adatokat átlag ± SD-ként ábrázoljuk (n = 4 MetS, n = 4 LD). A szívizomszövet reprezentatív képeit az x20 nagy teljesítményű mezőben mutatjuk be, ** p. 2. ábra. A miokardiális diétára adott válasz metabolikus aláírásait NMF-rel kapjuk.

LC/MS-MS-t alkalmaztunk a poláris metabolitok (280 poláris metabolitok) egyedileg történő azonosítására és mérésére a bal kamrai szívszövetben Yorkshire-ben ép hím sertésektől (MetS n = 6, LD n = 6). (A) Az LC/MS-MS 12 sertésből származó 280 poláros metabolit adatsora alapján az NMF kivonta az anyagcsere-folyamatok aláírásait, amelyek egyértelműen elhalasztottak a MetS és az LD között. Az egyes sertések azonosítása a rácsok alatt látható. A P1, P2, P3 és P4 aláírások színesek a sávok alatt. (B) Fürt dendrogram, amelyet felügyelet nélküli hierarchikus klaszterezéssel állítottak elő, az NMF által azonosított négy aláírás hozzájárulása alapján a 12 sertés metabolomikai adatbázisába (kofenetikai korrelációs együttható 0,92). (C) A P2 (LD) aláírás és a MetS aláírás (P4) felülreprezentált ismert útjait a MetaboAnalyst 4.0 határozza meg. P értéküket a jobb oldali színes oszlopdiagrammal mutatjuk be.

Összességében mindkét aláírás összehasonlítása a glikolízisre, a zsírsavakra, a HBP-re (hexozamin-bioszintetikus út), a glikogenolízis diszbalanciára utal MetS-ben.

A P2 és P4 metabolit-összetétele.

Az RNS-seq-t alkalmazzuk az enzimek mRNS-szintjének relatív változásainak értékelésére a szívizom MetS és az LD szövetekben. A diagramok négy egyedi MetS sertés és négy LD sertés metRS-szintjét mutatják be MetS-ben (zöld hordók), szemben az LD-vel (lila); PGAM1 (p = 6,2x10-2), ENO1 (p = 2,7x10-4), GAPDH (p = 0,97); PGM3 (p = 8,5x10-3), UAP1 (p = 6x10-1), FASN (p = 0,01); ACAT2 (p = 0,09), ACLY (p = 0,6), CPT1A (p = 2,5x10 -7), HMGCL (p = 0,04), OXCT1 (p = 4,8x10 -8), BDH1 (2,4x10 -12), PYGM (p = 1,4x10 -6), PHKA1 (p = 2,8x10 -8), PHKA2 (p = 0,08) és GYG1 (p = 1,4x10 -7). Az adatokat átlagként ± SD-ként adjuk meg (normalizált LD = 4, MetS = 4; p 70%, p 5. ábra. Szívfehérje O-GlcNAciláció MetS és LD körülmények között.

Az LD és MetS szívszövetek O-GlcNAcilezett fehérjék tartalmában különböznek. (A) A paraffinba ágyazott szövetmetszeteket anti-O-GlcNAcilezett antitesttel (piros) és simaizom alfa-aktinnal (zöld) festettük. A DNS-t DAPI-val (kék) festettük. A szöveti szakaszok azonossága (LD-sovány étrend kontroll, magas zsírtartalmú étrenddel etetett MetS-állatok és a MetS + sertés MetS + Ab versenytárs-szakaszai az antitest-versenytárs N-acetil-glükózamin beadása után) vannak feltüntetve. A sávok mutatják a MetS és az LD reprezentatív független szöveti szakaszainak átlagos értékét (n = 6 csoportonként) és a MetS-t, amelyek ellenanyag-versenytársat kaptak (cAb). (B) Western-blot szöveti lizátumokkal (50 μg fehérje/sáv) három reprezentatív LD sertésből (1., 2., 3. sáv) és három MetS sertésből (5., 6., 7. sáv); A 4. sáv lizátumot mutat 5 μg N-acetil-glükózamin versenyzőként történő beadása után. A jobb oldali oszlopok a specifikus antitest szignálok átlagos relatív értékét mutatják. Az adatok átlag ± SD; *** p 6. ábra: OGT- és OGA-tartalom az LD és MetS szívszövetekben.

(A) Az immunfluoreszcencia különbségeket mutat az OGA-tartalomban (vörös) az LD- és a MetS-szövetben, míg OGT-tartalmuk (piros) közel azonos: a zöld a simaizom alfa-aktin antitestet, a kék pedig a nukleáris DNS-t mutatja. Az azonos számú magszámú felületen a vörös festés intenzitását NIH ImageJ 1.31-vel mértük, a jobb oldali oszlopdiagram pedig a MetS sertések szövetszelvényeinek átlagos OGT és OGA festési értékét mutatja relatív pixelként (n = 4, *** p 6 páros végű olvasmányok/minta, 43x10 6 -139x10 6 tartományban a GENEWIZ-ben (South Plainfield, NJ). Az olvasmányokat a sertés referencia genomjához (USMARCv1.0) térképeztük fel a STAR aligner segítségével [26 ], és a HTSeq-count 0.5.3p9 verziójú [USMARCv1.0] annotált összes gén számszerűsített leolvasási számát [27]. A differenciál gén expressziós elemzést a GENEWIZ-n végeztük a DESeq Bioconductor csomaggal. seq véletlenszerű volt.

Kétdimenziós vékonyréteg-kromatográfia (TLC)

A vékonyréteg-kromatográfiát a kivont poláris metabolitokkal szilikagél G lemezeken végezzük, fluoreszcens indikátorral 254 nm-en (Sigma-Aldrich). Az első dimenziós elválasztást savas oldószeres rendszerben (etanol - 5 N NH4OH - H2O) végezzük 200: 9: 40 arányban; második dimenzió egy bázikus oldószerrendszerben (insolently formiát-hangyasav-víz) arány 110: 20: 5. A foltokat csak a standard molekula vándorlásával azonosítjuk UV-fényben.

Periódusos sav-Schiff (PAS), lipidolaj vörös O festés, Picrosirius vörös festés

A periódusos sav-Schiff (PAS) festést a Sigma-Aldrich cég PAS festési rendszerével végeztük (395. eljárás). A szívszövetben a festés főként a glikogénnel történő reakcióból származik, bár más szénhidrátok 6 makromolekulával is reagálhatnak. Lipid (Olajvörös O) festékkészletet (Bio Vision, K580-24 katalógus) használtunk a lipidek felhalmozódásának festésére. A Picrosirius vörös festést a Polysciences, Inc. kitjével végeztük, állatokonként négy tárgylemezt használtunk az adatok számszerűsítésére; tárgylemezenként négy képet készítettünk véletlenszerű területről, és az átlagos pozitív festést az Image J szoftver segítségével határoztuk meg.

Poláris metabolitok LC/MS-MS

A poláris metabolitokat 100 mg flash-fagyasztott szövetből extraháltuk 1 ml jéghideg 80% (v/v) metanollal és 0,6 ml acetonitrillel, majd 5500 QTRAP hibrid hármas kvadrupol tömegspektrométerrel (AB/SCIEX) elemeztük Prominence UFLC-vel összekapcsolva. HPLC rendszer (Shimadzu) SRM-mel, a [8] szerint. Az egyes metabolitok SRM átmeneteihez tartozó teljes ionáram csúcsterületeit a MultiQuant v2.0 szoftver (AB/SCIEX) segítségével integráltuk. LC/MS-MS-t végeztünk az egyedek sertésmintáin (12 sertés 12 független menetben). A MetaboAnalyst 4.0-t használták az ismert útvonal-részvétel azonosítására.

Nem negatív mátrixfaktorizálás (NMF)

Nem negatív mátrixfaktorizálást (NMF) alkalmaztunk a [10] -ben leírtak szerint, hogy az elemzett yorkshire-i sertésekben (MetS n = 6, LD n = 6) összesen 12 sertés metabolikus aláírásait keressük az LC/MS-MS adatsorában, amely 280 metabolitot tartalmaz . A hierarchikus klaszterezést úgy hajtották végre, mint [26, 28]. Az összes szimulációt Linux klasztereken futtattuk a Los Alamos Nemzeti Laboratóriumban.