A szénhidrátban gazdag étrend stimulálja a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz expressziót patkány máj szinuszos endothel sejtekben

Spolarics Zoltán szénhidrátban gazdag étrend stimulálja a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz expressziót patkány máj szinuszos endothel sejtekben, The Journal of Nutrition, 129. évfolyam, 1. szám, 1999. január, 105–108. Oldal, https://doi.org/ 10.1093/jn/129.1.105

serkenti

Absztrakt

A glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PD) 3 katalizálja a hexóz-monofoszfát sönt (HMS) első és sebességkorlátozó lépését. A szintetikus folyamatokhoz szükséges a NADPH és a HMS-ben termelt öt széncukor, amelyek alapvető szerepet játszanak a sejt redox állapotának fenntartásában (Cramer et al. 1995, Kletzien et al. 1994, Pandolfi et al. 1995, Spolarics 1998). A bazális G6PD expressziója a szövetekben nagyban változik, a legkisebb aktivitás az izomban mutatkozik meg, a legnagyobb pedig a fagocita sejtekben (Beutler 1990, Kletzien et al. 1994, Luzzatto és Mehta 1995). A G6PD expressziója számos fiziológiai és kóros ingerrel indukálható; a megemelkedett G6PD expresszió funkcionális jelentősége azonban különböző a sejttípusokban (Kletzien et al. 1994, Spolarics 1998). Korlátozott szintetikus kapacitású sejtekben, például RBC-ben a G6PD elsődleges szerepet játszik a reaktív oxigén-metabolitok eliminációjában (Beutler 1990, Luzzatto és Mehta 1995). A legújabb vizsgálatok ugyanakkor hangsúlyozták a G6PD jelentőségét a reaktív oxigénfajok metabolizmusának támogatásában a máj szinuszos sejtjeiben, valamint az extrahepatikus szövetekben (Cramer et al. 1995, Kletzien et al. 1994, Pandolfi et al. 1995, Spolarics 1998 ). A HMS által termelt NADPH szükséges a szuperoxid-anionok és a nitrogén-oxid termeléséhez, míg ezen fajok vagy metabolitjaik eliminációja a HMS-től függ a glutation-peroxidázok és a kataláz révén is (Spolarics 1998).

Korábban megmutattuk, hogy a G6PD divergens szabályozás alatt áll a májsejtekben. A bakteriális endotoxin in vivo stimulálta a G6PD expresszióját a máj endotheliális és Kupffer sejtjeiben, a parenchymasejtekben azonban nem. A szénhidrátban gazdag étrend stimulálja a G6PD expresszióját parenchimasejtekben, amelyekben az emelkedett HMS-aktivitás biztosítja a NADPH-t a de novo zsírsavszintézishez (Morikawa és mtsai 1984, Prostko és mtsai 1989, Volpe és Vagelos 1976). A máj szinuszos sejtjeiben a HMS táplálkozási szabályozásáról azonban nem áll rendelkezésre információ. Így feltételeztük, hogy az egypéldányos G6PD gént a máj mikrokörnyezetének funkcionálisan divergens sejttípusaiban a táplálkozási szénhidrátok nem szabályozzák egységesen. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a szénhidrátban gazdag étrend megváltoztatja-e a G6PD expresszióját az endotheliális és a Kupffer sejtekben, ha rövid ideig (48 órán keresztül) fogyasztják őket.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

A máj parenchymás és sinusoidális sejteket a korábban leírtak szerint izoláltuk (Spolarics 1996). A szinuszos és parenchimasejtek tisztasága> 94, illetve 99% volt; a sejtek életképessége a tripán-kék kizárással értékelve> 95, illetve 90% volt. A frissen előállított sejtek összes sejtes RNS-jét Northern blot analízisnek vetettük alá, a korábban leírtak szerint (Spolarics és Navarro 1994). Sprague-Dawley patkány G6PD cDNS-t, Susan Stapleton (Nyugat-Michigani Egyetem, Kalamazoo, MI) ajándékát véletlenszerű alapozó jelöléssel jelöltük. A hibridizációs jeleket a Phosphorimager SI analizátorral (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) számszerűsítettük. Az értékeket a hibridizáció előtt metilénkékkel festett 28S rRNS optikai sűrűségére normalizáltuk (Spolarics 1996).

A frissen izolált májsejteket 50 mmol/l Tris pufferben (pH 8,3) szuszpendáltuk, amely 100 mmol/l KCl-t, 0,2 mg/ml Triton X-100-ot, 0,01 mmol/l NADP + -ot és egy proteináz-gátló koktélt tartalmazott (Spolarics és Navarro 1994 ). A szuszpenziót ultrahanggal kezeltük, és a 14 000 x g felülúszó mintáiból elemeztük a G6PD és a 6-foszfoglukonát-dehidrogenáz (6PGD) aktivitását a korábban leírtak szerint (Spolarics és Navarro 1994).

Az adatok kiértékeléséhez ANOVA-t, majd Newman-Keuls tesztet alkalmaztunk. A ≤0,05 P-értéket szignifikánsnak tekintették. Az értékek átlag ± fél.

EREDMÉNYEK

Megvizsgáltuk a különféle étrendi kezelések G6PD aktivitásra gyakorolt ​​hatását az endothel és a Kupffer sejtekben (1A. Ábra). Meghatároztuk a 6PGD, a HMS második NADPH-termelő enzimjének aktivitását is (1B. Ábra). Az enzimaktivitásokat az ugyanazon májból előállított parenchimasejtekben is meghatároztuk, amelyek biológiai kontrollként szolgáltak (1C. Ábra, D). Az élelemhiányos patkányok sejtjeiben a G6PD aktivitás [nmol NADPH/(min⋅mg sejtfehérje)] 21,1 ± 2,2 endotheliumban, 8,9 ± 2,3 parenchymában és 135,9 ± 6,1 Kupffer sejtekben. Az átlagos 6PGD-aktivitás [nmol NADPH/(min⋅mg sejtfehérje)] a táplálékhiányos patkányok sejtjeiben 24,5 ± 3,9 volt az endotheliumban, 42,6 ± 3,4 a parenchymában és 136,5 ± 5,6 Kupffer-sejtekben. A többi csoportban az enzimaktivitást az ételtől mentes patkányokhoz viszonyítva fejeztük ki.

A szénhidrátban gazdag étrend hatása az (A) glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és (B) 6-foszfoglukonát-dehidrogenáz aktivitására patkány szinuszos endothel és Kupffer sejtekben. Összehasonlításképpen, az ugyanazon májból izolált parenchimasejtek eredményeit is bemutatjuk (C, D). Az enzimaktivitásokat a frissen izolált májsejtek citoszoljában mértük, különféle táplálkozási rend szerint tartott patkányokból. Az eredményeket az élelemhiányos patkányok sejtjeiben kifejtett aktivitáshoz viszonyítva fejezzük ki. A sávok átlag ± ±, n = 6–8 független sejtpreparátumot jelentenek. A sávok fölötti különböző betűk szignifikánsan eltérő eszközöket jeleznek, P 1C, D ábra) (Morikawa et al. 1984, Prostko et al. 1989, Volpe 1976). A diétás kezelések miatti 6PGD-aktivitás különbségei hasonlóak voltak az endothel- és parenchymasejtek G6PD-jéhez képest.

Az élelmiszer nélkülözés utáni magas szénhidráttáplálás 300% -kal nagyobb egyensúlyi állapotú G6PD mRNS-koncentrációt eredményezett az endoteliális sejtekben, mint az élelemhiányos patkányok sejtjei (2. ábra). A táplálékhiányos patkányok normál étrenddel történő visszatáplálása nem eredményezett magasabb szintű G6PD mRNS-t az endoteliális sejtekben. A Kupffer-sejtekben a szénhidrátban gazdag étrend nem befolyásolta a G6PD mRNS egyensúlyi állapotát, összhangban a nem befolyásolt enzimaktivitással. A parenchimasejtek reprezentatív blotja, amelyet a 2. ábrán is ábrázolunk, azt jelzi, hogy a G6PD mRNS nem volt kimutatható táplálékhiányos patkányok parenchimasejtjeiben, míg a szénhidráttal történő etetés vagy a szokásos étrend megemelte a G6PD mRNS szintjét, összhangban a korábban publikált megfigyelésekkel 1994, Morikawa és mtsai 1984, Prostko és mtsai 1989, Volpe 1976).

A szénhidrátban gazdag étrend serkenti a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz mRNS-bőségét patkány szinuszos endoteliális sejtekben. A frissen izolált májsejtek összes RNS-jét Northern blot analízisnek vetettük alá. Az egyes membránokon lévő jeleket foszfoimázs analizátorral számszerűsítettük, és a hibridizációk előtt festett 28S rRNS optikai sűrűségére normalizáltuk. Az eredményeket az élelemhiányos patkányok sejtjeiben lévő jelekhez viszonyítva fejezzük ki. A sávok átlag ± ±, n = 4–7 független sejtpreparátumot jelentenek. A felső panel egy reprezentatív Northern blot leletet ábrázol. Összehasonlításképpen a parenchymasejtek tipikus eredményét is bemutatjuk. A sávok fölötti különböző betűk jelentős eltéréseket jeleznek, P Spolarics és Navarro 1994, Spolarics és Wu 1997). Az endothel sejtekben a G6PD megnövekedett aktivitása a szacharózfertőzés hatására az mRNS szintjének növekedésével jár, ami arra utal, hogy a felelős mechanizmus a génaktiváció és/vagy az mRNS megnövekedett stabilitása az endothelsejtekben, hasonlóan a parenchymasejtekben megfigyelthez (Fritz és mtsai. 1986, Manos et al., 1991).

Nincs bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a szinuszos endoteliális sejtek hozzájárulnának a máj de novo zsírsavszintéziséhez, ami arra utal, hogy a G6PD és a 6PGD emelkedése nem függ össze a stimulált zsírsav anabolizmussal ezekben a sejtekben. Javasoljuk, hogy az endothelium táplálkozási szacharózra adott reakciókészsége olyan szabályozó mechanizmusokkal társuljon, amelyek megmaradnak az endothel sejtekben, de a differenciálódásuk során elvesznek a Kupffer sejtekben. Ezeknek a sejteknek az inzulinérzékenységében mutatkozó különbség nem hihető magyarázat a divergens válaszokra, mivel mindkét szinuszos sejttípus megemelte a glükózfelvételt az in vivo inzulin beadása után (Spolarics et al. 1992). A szacharóz-diéta pontos mechanizmusa a G6PD gén aktiválásában a parenchimasejtekben szintén nem ismert (Kletzien és mtsai 1994). Ezért a májsejtek divergens válaszaiért felelős mechanizmus még tisztázatlan.

A változó koncentrációjú telített és többszörösen telítetlen zsírsavakat tartalmazó étrend megváltoztatja a G6PD expresszióját (Stabile és mtsai. 1996, Taniguchi és mtsai. 1994, Tomlinson és mtsai. 1988), és modulálja az oxidatív burst és az oxidáns károsodást a makrofágokban és a pulmonalis endothelsejtekben (Eicher és McVey 1995, Guimaraes és mtsai., 1992, Hart és mtsai., 1991). Mivel az ebben a tanulmányban alkalmazott étrend lipid-lerakódást okoz a májban, még tisztázni kell, ha a máj lipid-felhalmozódása, vagy étrendi vagy keringő zsírsavak részt vesznek a G6PD expressziójának indukciójában a szinuszos endothel sejtekben.

Összességében ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy a májban az egypéldányú G6PD gén tápanyag-szénhidrátok által sejtspecifikus szabályozás alatt áll. Ezeknek a sejteknek a reakciókészsége nem függ össze endodermális vagy mesenchymalis származékukkal vagy a de novo zsírsavszintézis belső képességével. A G6PD promoterre ható jelátviteli utak különbségei, a citoplazmatikus környezet egyedisége, a sejtek differenciálódásának mértéke vagy az ezzel járó oxidatív stressz szintje mind felelősek lehetnek a különálló sejtes válaszokért. A diéta által kiváltott megnövekedett G6PD expresszió az endothel- és parenchimasejtekben modulálhatja a májreakciókat az endotoxemia, a szepszis vagy az ischaemia-reperfúzió során, amikor a toborzott neutrofilekből vagy rezidens makrofágokból származó oxidánsok megcélozzák a szinuszos endotheliumot, majd a parenchymát.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönjük Jun-Xi Wu-nak a kiváló technikai segítséget, és Susan Stapleton-nak az eredeti G6PD cDNS biztosítását a vizsgálatokhoz.