A kronológia Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866), Kamensky, 1905: Fertőzés in Biomphalaria glabrata (Mondjuk, 1818)

1 Egészségtudományi Tanszék, Szövetségi Lavrasi Egyetem, Lavras, Minas Gerais 37200-000, Brazília

2 Parazitológiai Tanszék, Minas Gerais szövetségi egyetem, Minas Gerais, Brazília

3 Állatorvos-tudományi Tanszék, Agrár- és Állatorvos-tudományi Kar, Trás-os-Montes e Alto Douro Egyetem (UTAD), 5000-801 Vila Real, Portugália

Absztrakt

1. Bemutatkozás

Angiostrongylus vasorum (Baillet, 1866) Kamensky, 1905 egy metasztrongyloid fonálféreg, amely parazitál a vadon élő és a házi rovarokon. A felnőtt férgek gazdáik jobb kamrájában és pulmonalis artériájában találhatók, amelyek köhögést, nehézlégzést, csökkent testtűrést, fogyást, hányást, neurológiai tüneteket, vérzési rendellenességeket, szívelégtelenséget és végső soron halált okoznak [1]. Életciklusa A. vasorum heteroxén, több vízi és szárazföldi hasláb közbenső gazdaszervezetként vesz részt, például a fajba tartozó csigák Achatina fulica és Biomphalaria glabrata [2–6]. Az első stádiumú (L1) lárvákat a kanidák ürülékében bocsátják ki, és tovább fejlődnek a két vedlés mentén a harmadik stádiumig (L3) a köztes gazdaszervezetekben [7]. A végleges gazdaszervezetek megfertőződnek az L3 lenyelésével, amely felszabadulhat a környezetben vagy lenyelhető egy zsákmánnyal (köztes vagy paratén gazda) [8].

Számos kérdés merül fel az életciklussal és a továbbadással kapcsolatban A. vasorum ezt ki kell deríteni [4]. A köztes gazdák fejlődésének és a lárvák dinamikájának ismerete elengedhetetlen a gazda-parazita kapcsolat jobb megértéséhez, amely körülmény hozzájárulhat az angiostrongylosis elleni védekezési stratégiák kialakításához.

Jelen munka a behatolási helyeket és a migrációs útvonalak időrendjét vizsgálta A. vasorum lárvák be Biomphalaria glabrata és értékelte ennek a köztes gazdaszervezetnek a perilarval reakcióját, a sejtösszetételt és a gasztropoda fertőzésre adott válaszában szerepet játszó szövettani változásokat illetően.

2. Anyagok és módszerek

A A. vasorum az alkalmazott törzset egy természetesen fertőzött házi kutya ürülékéből izolálták (Canis familiaris), a brazíliai Minas Gerais-ben, Caratingában él. A fonálférgeket házi kutyák és vízi csigák soros fertőzésével tartották fenn (B. glabrata) a Brazil Minas Gerais Szövetségi Egyetem (UFMG) Parazitológiai Tanszékének Állatorvosi Helminthológiai Laboratóriumában. Az ebben a munkában elvégzett kísérleti eljárásokat az UFMG Etikai Bizottság hagyta jóvá (protokollszám: 060/03), és azokat a kísérleti tudományban elfogadott állatjóléti elveknek megfelelően alkalmazták.

2.1. Gastropoda fertőzés

Az első stádiumú (L1) lárvák A. vasorum a laboratóriumban tartott telepről nyerték. A lárvákat a módosított Baermann-készülék segítségével nyertük ki a kutyák ürülékéből [8]. Harmincnyolc laboratóriumban nevelkedett B. glabrata, 10–15 mm héjátmérőjű, hat üreges polisztirol tenyésztési tesztlemezeken fertőztük meg, 3 ml vízzel és 1 000 liter A. vasorum minden egyes. 24 óra múlva a haslábúkat akváriumba vitték [8].

2.2. Időrendi tanulmány

A fertőzés során (30 perc; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 és 24 óra; és 2, 3, 4, 5, 6, 8, 14, 20, 30 és 60 nap ), két csigát véletlenszerűen levettek az akváriumból a fertőzés minden előre meghatározott idejének értékelése céljából. A héjakat perforáltuk, és az egész csigákat foszfáttal pufferolt formalinban [9] rögzítettük, 10% EDTA-oldatban 15 napon át meszeltük le a héj demineralizálásához. A haslábúak lágy részeit elválasztották a héjától és automatikus szövetfeldolgozóba helyezték dehidratálás, diafanizálás, beágyazás és paraffinba történő beépítés céljából. Ezután a mintákat 5-be vágtuk μm soros metszetek egy mikrotómában, és a hat tárgylemezből egyet hematoxilinnal és eozinnal festettünk. A metszeteket elemeztük, és a képeket fényes mezõs mikroszkóppal készítettük (Carl Zeiss, Németország).

3. Eredmények

Mind a szájon át, mind a bőrön keresztül megfigyelték a fertőzést. A fibromuscularis szövet lárva tropizmusa ellenére néhány lárva különböző szervekben és szövetekben helyezkedett el a vizsgálati időszak alatt, amint azt az 1. táblázat mutatja. Orális fertőzés esetén több lárvát figyeltek meg az emésztőrendszer lumenében. Néhányuk az emésztőrendszer falának különböző rétegeiben helyezkedett el. A bőrfertőzés magában foglalta a hámsejtek lárvák általi disszociációját, amely behatolt a tegumentumba, majd elérte a lábfejet vagy a fibromuscularis szövetet. Azonban nem lehet megkülönböztetni a fertőzés útját, amikor a lárvákat a kötőszövetben, az emésztőmirigyben, a hemocélában vagy a keringési rendszerben találták. Az ezen útvonalak bármelyikébe belépő lárvák ezekhez a szövetekhez helyezhetők el.

A legtöbb lárvát ez utóbbiban találták, sejtes aggregátummal körülvéve vagy sem, itt hemocita válaszként hívták, változó reakciófokú (2. táblázat).

1 nap elteltével (2. (f) és 2. (g) ábra) a paraziták nagy része a pedál tömegének izomszöveteiben volt elhelyezve, körülvéve intenzívebb pregranuloma képződésű sejtreakcióval, egyes esetekben sejtmigrációt mutatva a a lárvák homorú felülete. A lárvákat (L1) 48 óra elteltével figyeltük meg a köpenyüreg hámjában és a tüdőszövetben (2. ábra (h)). 6 nap elteltével (3. a) és 3. b) ábra) több tipikus granuloma oszlott el a pedál területén, és először találták meg a parazitákat az albumin mirigy közbenső részében. A lárvákat a vese keringési rendszerében és a hemocélában, a kötőszövetben is megtalálták, az emésztőmirigy diverticulái és a fertőzött csigák pszeudogillje között 14 nap után (3. (c) és 3. (d) ábra). A fertőzés 20. napján (3. ábra (e)) a megfigyelt minta hasonló volt, bár különböző szöveti reakciókkal. 30. napon (3. (f) –3 (h) ábra) a lárvák a pedál tömegében, a vese, az álgill, a jobb-végbél szövetében és a kolumelláris izom közelében lévő kötőszövetben helyezkedtek el, és a fertőzés 60. napján ( A 4. (a) –4. (E) ábra), a hemolimfában, a pedál tömegében és a hemocélában szabadon találtak, nagyon gyenge reakcióval.

4. Megbeszélés

1960 óta, amikor a nemzetség haslábúi Arion bebizonyosodott, hogy részt vesznek a A. vasorum [7], néhány új, a gazda-parazita kapcsolatra összpontosító vizsgálatról számoltak be [4, 8]. Jelen tanulmány a B. glabrata által okozott fertőzés A. vasorum. Megfigyelhető volt az orális és a bőr fertőzés, majd az L1 átterjedése több szövetre és szervre, valamint a lárvákat körülvevő hemocita válasz módosulása.

A Metastrongyloidea rend fonálférgei, beleértve a A. vasorum, megfertőzik az emésztőrendszerükbe és/vagy a tegument behatoló köztes gazdájukat [10–15]. Jelen munka során az emésztőrendszer falán keresztüli lárvák inváziója egymást követő lépésekben következett be, és nem mutatott előnyben részesítést a meghatározott szegmensek iránt, amint azt más szerzők korábban megfigyelték [16–18]: tapadás a hámfelülethez, a transzepitheliális vándorlás a bazális membránhoz, a bazális membrán transzpozíciója és a kötőszubepiteliális szövet behatolása. A bőrfertőzés bizonyítékai között szerepelt az epitheliába behatoló lárvák megfigyelése és az L1 jelenléte közvetlenül a tegument felett a fertőzés első perceiben és óráiban. Ezt a két fertőzési utat más angiostrongylidok is megerősítették [10, 11, 13, 15]. Valójában a Angiostrongylus costaricensis orális és perkután úton is egyidejűleg fordul elő, amint azt a szövettani metszeteknél megfigyelték [19]. Azok a molekuláris mechanizmusok azonban, amelyek részt vesznek az L1 lárvák és a haslábak emésztőrendszerének különböző szegmenseiből származó hám kölcsönhatásában, még mindig nem ismertek.

Jelen tanulmányban az L3 számának esetleges csökkenése a mintákban 30 és 60 napos fertőzéssel jelezheti, hogy a lárvák eliminálódtak. Ebben az időszakban a lárvák morfológiája nem mutatott rendellenességeket, ami azt mutatta, hogy a lárvák túléltek gazdáikban. Ezek a tények azt jelzik, hogy a lárvák a környezetben megszűnnek, ahogy más szerzők is javasolják [20]. Conboy és mtsai. [21] beszámolt a spontán levett L3 metasztrongyloid kimutatásáról a kísérletileg fertőzött meztelen csigák székletében. Jelen tanulmányban a végbélhez közeli L3 lárvák jelenléte arra is utalhat, hogy ez a régió valószínűleg a lárvák A. vasorum.

A gazdaállományon belüli fertőzés és vándorlás során a lárvák helyenként visszatartódhatnak, főleg a fibromuscularis szövetben, körülvéve vagy sem hemocita reakcióval. Egyes lárvák (L1) azonban átterjednek a szervezeten, enzimek, például proteázok segítségével mozognak a szövetekben, vagy bejutnak a keringési rendszerbe, és edényekben és orrmelléküregekben áramlanak, amíg el nem érnek egy szövetet vagy szervet. Jelen munkában a behatolás és az invázió előnyösen az első 5 órában következett be. A zsigereken keresztüli migráció azonban hosszabb ideig megy végbe. A lárvák előnyösen eljutnak az emésztőrendszerbe, a vese, a gyomor-bél traktusba, a tüdőbe, a pszeudobranchiába és a kötőszövetbe.

Több mű is talált nagy mennyiségű Angiostrongylus lárvák a fibromuscularis szövetben [14, 16, 17]. Montresor és mtsai. [17] arra utal, hogy nagyszámú lárva A. costaricensis a fibromuscularis szövetben a bőséges hemolimfatikus vaszkularizáció következménye ebben a szövetben. Richards és Merritt [14] azt javasolta, hogy a A. cantonensis az emésztőrendszer falán keresztül behatoló lárvák eljutnak a hemocoelig, ami a fibromuscularis szövethez és a lábhoz vezet.

A perilarvalis reakció kialakulása a fertőzés 5 órájától kezdődött, és a lárvák rendeltetésétől független fejlődési mintázatot mutatott. Az integumentumba behatoló lárvák (L1) azonban a láb fibromuscularis szövetéhez kapcsolódhatnak, míg a lenyelt állatoknak a bélhám bármely szintjén történő áthaladásához és a behatolás helyére jellemző sajátosságok nélkül kellett átjutniuk a többi belső szervhez hemocoel vagy közvetlen érintkezés útján. Ezenkívül a lárvák nyilvánvalóan bármikor elérhetik a különféle szerveket, mivel az expozíciós idő kezdetén kerülnek lenyelésre.

A haslábúakban a sejtes választ hemociták (koelomociták vagy amoebociták) hajtják végre, amelyek egy fagocita sejtek, amelyek a kórokozók köré csoportosulnak (kapszulázódnak) és humorális köztitermékeket termelnek. Jelen tanulmányban azt figyeltük meg, hogy a lárvákat nem károsította a hemocita reakció, és a csigák szövetei és szervei nem degenerálódtak. A hemocita reakció a lárvák körül koncentrálódott, és a hemocita aggregáció ezen pontjait leszámítva a szövetek és szervek normális megjelenést mutattak. A parazita jól fejlődhetett, még ha hemocitákkal is körülvették. Például ismert, hogy a metasztrongyloid lárvák túlélnek a sejtes reakcióban [16, 22]. Néhány tanulmány a gazda immunválaszának paraziták általi kiaknázását is tárgyalja [23, 24], és az angiostrongylidok kapszulázását egy ilyen folyamat példájának tekintették [16, 17, 22].

Kezdetben a sejtek sűrűségét a lárvák körül állapították meg, majd a fibroblaszt-szerű sejteket differenciálva 6 napos fertőzésből pseudokapszulát képeztek. Más szerzők [25, 26] is javasolták az amoebociták ezen differenciálódását a fibroblasztokban. Ugyanezt a mintát figyelték meg a A. cantonensis fertőzések B. glabrata. A lárvák körüli tiszta tér kialakulása más angiostrongylidákban gyakori jelenség, és a lárvák által termelt potenciális proteolitikus enzimeknek tulajdonítják [16]. Ezt a szövettani mintát azonban nem szabad összetéveszteni azokkal a lárvákkal, amelyek a láb nyálka sejtjeibe jutnak, és amelyeknek hasonló a megjelenése, valamint a szövetek visszahúzódásának, a szövettani tárgynak a lehetőségével. Jelen tanulmányban nem sikerült bizonyítani, hogy a lárva proteolitikus aktivitása felelős a lárvaszakaszokat és a környező gazdaszövetet elválasztó tiszta terekért. A tiszta tereket azonban több mintában megfigyeltük. Ez azt sugallja, hogy meg kell vizsgálni, hogy ez a jelenség proteolitikus enzimeknek köszönhető-e, amint azt már bizonyították A. costaricensis megfertőzve Sarasinula marginata [16].

Ez a munka kimutatta a B. glabrata által A. vasorum orális és perkután utakon történik, meghatározott vándorlási mintázat nélkül. Hasonlóképpen, a fertőzés helyén a hemociták szisztémás mozgósítása indukálódik, ami a perilarvalis reakciót okozza, bár a lárvák pusztulása nélkül. A fonálféreg növekvő állatorvosi jelentősége A. vasorum és a zoonózis-potenciállal kapcsolatos kérdések megerősítik a gazda-parazita kapcsolat tanulmányainak fontosságát. Tanulmányok, amelyek összehasonlítják a hemocita reakciójának morfológiai aspektusait A. vasorum a különféle haslábúak fertőzése hozzájárulhat a gerinctelenek veleszületett immunrendszerének jobb megértéséhez. Ezenkívül felhasználhatók a parazita elleni védekezési módszerek tanulmányozásának és fejlesztésének eszközeként is.

Adatok elérhetősége

A tanulmány eredményeinek alátámasztására használt adatokat a cikk tartalmazza.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

Köszönetnyilvánítás

Külön köszönetet szeretnénk mondani Dr. Henrique Leonel Lenzi-nek, aki bár már nem velünk van, továbbra is inspirálja példáját és odaadását azoknak a hallgatóknak, akiknek pályafutása során szolgált. Hálásak vagyunk a Lângia Coli Montresor és a Teofânia Heloisa Dutra Amorim Vidigal tudományos támogatásáért is. Ezt a kutatást az Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), az Universidade Federal de Lavras (UFLA) és a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) támogatta.