Az éhezést utánzó étrend időszakos beadása beavatkozik a cukorbetegség progressziójába, helyreállítja a β sejteket és rekonstruálja a bél mikrobiotáját egerekben

Siying Wei

CAS Táplálkozási, Anyagcsere- és Élelmiszer-biztonsági Laboratórium, Sanghaji Táplálkozási és Egészségügyi Intézet, Sanghaji Biológiai Tudományok Intézete, Kínai Tudományos Akadémia, Kínai Tudományos Akadémia, 320 Yueyang Rd, Sanghaj, 200031 Kína

Ruomei Han

Jingyu Zhao

Shuo Wang

Meiqin Huang

Yining Wang

Yan Chen

Társított adatok

A felhasznált adatok és anyagok kérésre rendelkezésre állnak.

Absztrakt

Elektronikus kiegészítő anyag

A cikk online verziója (10.1186/s12986-018-0318-3) kiegészítő anyagot tartalmaz, amely az engedélyezett felhasználók számára elérhető.

Bevezetés

Ebben a tanulmányban azt kívántuk megvizsgálni, hogy egy új típusú alacsony fehérjetartalmú alacsony szénhidráttartalmú FMD képes-e beavatkozni az egerek 2-es típusú cukorbetegségébe. Különösen azt kívántuk megvizsgálni, hogy ennek az FMD-nek a szakaszos beadása képes-e helyreállítani a db/db egerekben elveszett β-sejtek működését; és hogy a bél mikrobiota hozzájárulhat-e az FMD intervenciós hatásához.

Módszerek és anyagok

Egér modell

Az SLAC-tól (Sanghaj, Kína) vásárolt hathetes hím C57BL/ksJ-db (db/db) egereket kórokozótól mentes körülmények között tartottuk, és 12 órás világos/sötét ciklusban tartottuk a Táplálkozástudományi Intézetben. Az összes egeret megmértük a vizsgálat kezdetén, és véletlenszerűen két csoportba soroltuk: standard táplálékot és szabad hozzáférést az élelemhez és vízhez (CTRL), valamint szakaszos éhezést az FMD-vel (

A CTRL csoport napi kalóriabevitelének 30% -a) 1 hétig, majd további hétig ad libitum táplálás (FMD). Az 1-es típusú diabéteszes egér modell esetében alacsony dózisú sztreptozotocint (STZ) (40 mg/kg) injektáltak intraperitoneálisan öt egymást követő napon keresztül. Az egereket lemértük és éheztettük 8 órával az STZ injekció előtt. Az STZ-t nátrium-citrát pufferben (pH 4,5) oldottuk, és azonos térfogatú citrát puffert injektáltunk kontroll egerekbe. Ezeket a kísérleteket a Sanghaji Biológiai Tudományok Intézetének (SIBS), a Kínai Tudományos Akadémia (CAS) Táplálkozástudományi Intézetének Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottságának irányelveivel összhangban végezték el, jóváhagyási számuk 2010-AN-8.

Az étrendet utánzó egér böjt

A tanulmányban használt FMD-t (kínai nevén Gembynear Nutrition Bar vagy kínaiul Zhenbainian) a Pekingi Táplálkozási, Egészségügyi, Élelmiszertudományi és Technológiai Kutatóintézet (Peking, Kína) szívesen nyújtotta. A száj- és körömfájás összetételét és táplálkozási adatait az 1. kiegészítő fájl tartalmazza: S1 és S2 táblázat. Minden egeret reggel friss élelemmel láttak el (9: 00-10: 00). Az FMD egerek általában az első néhány órában elfogyasztották a szállított táplálékot.

Egerek székletminta gyűjtése

Valamennyi egeret egyedileg ketrecbe helyeztük. Minden egérből friss székletmintákat gyűjtöttünk 14:00 órakor.

15:00. a lehetséges cirkadián hatások minimalizálása érdekében. A mintákat jégen üres mikrocsövekbe gyűjtöttük, és a későbbi felhasználás céljából azonnal -80 ° C-on tároltuk.

A vércukorszint és az inzulin mérése

Az egereket 6 órán keresztül éheztettük (reggel 9:00.

15:00 óra) a vércukorszint mérése előtt. A vércukorszintet a farokvénán keresztül mértük a OneTouch UltraEasy vércukorszint-ellenőrző rendszerrel (Lifescan, Milpitas, CA, USA). A szérum inzulinszintet egér enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal határozták meg (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Shanghai, Kína). A szemgömbből teljes vért vettünk, és a plazmát 3000 fordulat/perc sebességű centrifugálással 15 percig elválasztottuk EDTA-K2-vel kezelt mikrocsövekben (Kangjian Medical, Kína). A homeosztatikus modell értékelést (HOMA) alkalmazták az inzulinrezisztencia (HOMA-IR) és a β sejtfunkció (% B) számszerűsítésére. A HOMA-IR-t a következő képlet segítségével számoltuk: HOMA-IR = (éhomi glükóz × éhomi inzulin)/22,5. A HOMA% B-t a következő képlet segítségével számoltuk ki: HOMA-% B = (20 × éhomi inzulin)/(éhomi glükóz - 3,5)%.

Glükóz tolerancia teszt (GTT) és inzulin tolerancia teszt (ITT)

Az egereket külön-külön ketrecben tartottuk, és 4 órán át éheztettük az ITT-t (reggeli koplalás), és egy éjszakán át éheztettük a GTT esetében. Glükózt (2 g/kg) vagy inzulint (2 egység/kg) intraperitoneálisan injektáltunk. A vércukorszintet minden injekció után 0, 15, 30, 60 és 90 percnél mértük.

A szérum és a máj paramétereinek mérése

Az egereket eutanizáltuk, és a vért a orbitális sinusból azonnal EDTA-K2-vel kezelt mikrocsövekbe vettük (Kangjian Medical, Kína). Ezután a mikrocsöveket 3000 fordulat/perc sebességgel 15 percig centrifugáltuk, és a plazma felülúszót 3 részre osztottuk különböző felhasználások céljából. Az összes plazmamintát, kivéve az azonnali felhasználásra szánt mintákat, -80 ° C-on tároltuk. A máj lipidjeit kloroform/metanol (2: 1) eleggyel extraháltuk. Az aszpartát-transzamináz (AST) és az alanin-transzamináz (ALT) plazmaszintjét AST/ALT meghatározó készlettel (ShenSuo UNF, Kína) határoztuk meg. A trigliceridek (TG) és az összkoleszterin (TC) plazma- és májszintjét kolorimetriás módszerekkel határoztuk meg a megfelelő készletekkel (ShenSuo UNF, Kína). Mindezeket a vizsgálatokat a gyártó utasításai szerint hajtották végre.

Immunfluoreszcencia elemzés

Az egérszöveteket 4% paraformaldehidben rögzítettük, dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk. A szöveteket vastag szeletekre (4 μm) osztottuk, paraffinmentesítettük xilolban, és etil-alkoholos sorozatokkal (100%, 90%, 70%, 50% és 30%) és vízzel rehidratáltuk. Az antigént hőkezeléssel nyertük fel 0,1 M citrátpufferrel (pH = 6,0), és a metszeteket blokkoló pufferrel (PBS + 1% normál kecskeszérum + 0,1% trixton-100) blokkoltuk. A következő elsődleges antitesteket használtuk: anti-inzulin (C27C9, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), anti-glükagon (ab10988, Abcam, MA, USA), anti-Ngn3 (sc-374442, Santa Cruz Biotechnology, Dallas), Texas, USA) és anti-Ki67 (550609 a BD Biosciences-től, New Jersey USA). A metszeteket primer antitestekkel egy éjszakán át nedvesített kamrában inkubáltuk. PBS-sel végzett mosás után a metszeteket 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk szekunder antitestekkel (Alexa Fluor 488 szamár anti-nyúl IgG, Alexa Fluor 546 szamár anti-egér, hígítás 1/500). Az összes szekunder fluorokróm-konjugált antitestet a Life Technologies-től (Eugene, OR, USA) szereztük be. A festett metszetek képeit 40x-es objektív segítségével készítettük LSM 510 konfokális mikroszkóppal (Zeiss, Jena, Németország).

Májminták H&E festése

Az egérmájat boncoltuk és PBS-ben mostuk. Az összes szövetet 4% paraformaldehidben rögzítettük 48 órán át szobahőmérsékleten, dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk. Ezután a szöveteket vastag szeletekre (4 μm) osztottuk és hematoxilinnal és eozinnal (H&E) festettük.

RNS izolálás, RT-PCR és valós idejű PCR

Az egér májszöveteit TRIzol reagensben (Invitrogen, CA, USA) lizáltuk. A teljes RNS-t a gyártó utasításai szerint tisztítottuk, reverz átírással és szintetizáltuk komplementer DNS-re FastQuant RT Kit (gDNase-vel) (Tiangen Biotech Co., LTD, Peking, Kína) felhasználásával. A valós idejű PCR-t az ABI Prism 7900 szekvencia detektáló rendszerrel végeztük a gyártó ajánlásait követve (Applied Biosystems, CA, USA). A relatív mRNS-szinteket az összehasonlító ΔCT módszerrel számszerűsítettük, és az 1. kiegészítő fájlban leírt primerek szekvenciájával normalizáltuk aktinná: S4 táblázat.

A bél mikrobiotájának elemzése

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag ± SEM-ben fejeztük ki. A jelentős különbségeket vagy kétfarkú Student t-tesztekkel, vagy egyirányú ANOVA-val értékelték, majd adott esetben a Student-Newman-Keuls tesztet.

Eredmények

Az FMD szakaszos beadása a testtömeg jelentős változása nélkül beavatkozik a 2-es típusú cukorbetegség kórképébe db/db egerekben