Bőséges növényi alapú kis RNS kimutatása egészséges fogyasztókban

Tartozás USDA/ARS Gyermektáplálkozási Kutatóközpont, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Kapcsolatok USDA/ARS Gyermektáplálkozási Kutatóközpont, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, Amerikai Egyesült Államok, Zöldség- és gyümölcsjavító központ, Texas A&M Egyetem, College Station, Texas, Amerikai Egyesült Államok

Jian Yang,
Lisa M. gazda,
Abia A. A. Agyekum,
Ismail Elbaz-Younes,
Kendal D. Hirschi

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Yang J, Farmer LM, Agyekum AAA, Elbaz-Younes I, Hirschi KD (2015) Bőséges növényi alapú kis RNS kimutatása egészséges fogyasztókban. PLoS ONE 10 (9): e0137516. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137516

Szerkesztő: Maoteng Li, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, KÍNA

Fogadott: 2015. április 30 .; Elfogadott: 2015. augusztus 18 .; Közzétett: 2015. szeptember 3

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és annak kiegészítő információ fájljában.

Finanszírozás: L.M.F. az NIH támogatásával támogatta (5T32HD071839-02). Ezt a munkát az USDA/ARIS 6250-51000-051-00D és a Szója Egészségügyi és Szárazbab Egészségügyi Kutatási Program forrásai támogatták.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A kis RNS-ek számos növényi táplálékban bővelkednek, és egyesek tökéletesen kiegészítik az emberi géneket [8]. Egy jelentés, amely több paradigmát is megkérdőjelezett, azt javasolta, hogy a bevitt növényi alapú miRNS-ek átkerüljenek a vérbe, felhalmozódjanak a szövetekben, és szabályozzák az állatok endogén génexpresszióját [9]. Ezt követően változó szintű sikerről számoltak be az exogén étrendi miRNS-ek kimutatásában emlősök fogyasztói körében [10–16]. Eddig a növényi eredetű étrendi kicsi RNS-eket nehéz volt kimutatni az egyetlen adag ételt fogyasztók szérumában [15, 17].

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

A Baylor College of Medicine IACUC jóváhagyta az egerek etetésével kapcsolatos vizsgálatokat és minden más kísérleti eljárást. Az összes egeret a Baylor College of Medicine összehasonlító orvoslásának központjától szereztük be. Minden etetési vizsgálatban 8-10 hetes hím ICR egereket alkalmaztak, amelyeket legalább háromszor replikáltak; a bemutatott eredmények reprezentatívak a biológiai replikátumokra. Az egerek gyógynövény- és virágdiétáit különféle helyi kínai gyógynövény- és tonikboltokban nyert finomra őrölt növényi szövetekből készítették. A növény-chow étrendeket finoman őrölt chow, növényi anyag és víz 2: 1: 2 tömegarányú keverésével állítottuk elő. Az amoxicillint (50 mg/kg/nap) és a trimetoprim-szulfát (TMS) (160 mg/kg/ml) adtuk az ivóvízbe abból a feltételezésből kiindulva, hogy az egerek naponta 5,0 ml vizet ittak [21]. A farokvénák injekcióit a szokásos protokollok szerint végeztük [22]; Az egyes RNS-ekből 50 fmol-t szuszpendáltunk 100 μl foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS), és injektáltuk az oldalsó farokvénába. Szintetikus miRNS-eket az Integrated DNA Technologies cégtől nyertünk. Az antibiotikumokat a Sigma cégtől szereztük be.

Szérum- és vizeletgyűjtés és RNS-kivonás

A vért egerek retro-orbitális vérzésével vettük fel, és hagytuk szobahőmérsékleten 1 órán át koagulálni a szérum izolálása előtt. A szérumokat 800 x g-vel 10 percig szobahőmérsékleten centrifugáljuk, majd 10 000 x g-vel 4 ° C-on 10 percig centrifugáljuk az összes vérsejt és törmelék eltávolítása céljából. Az ürüléktől mentes tiszta vizeletmintákat az egerek parafilm fölé tartásával és a vizeletürítés ösztönzésével gyűjtöttük [23]. A teljes RNS-t 100 μl szérumból vagy 80 μl vizeletből extraháltuk a Qiagen miRNeasy Mini Kit segítségével, a gyártó ajánlása szerint. A vizeletmintákhoz 1 pmol szintetikus MIR161-et adtunk exogén RNS kontrollként.

A miRNS-szintek elemzése qRT-PCR-rel

Taqman mikroRNS vizsgálatokat a let-7dgi [24], miR-16, MIR161, MIR2911, MIR156a, MIR168a és mesterséges miRNS C7 esetében a Life Technologies cégtől kaptuk. Minden reverz transzkripciós (RT) reakcióban 10 μl szérumnak vagy 8 μl vizeletnek megfelelő teljes RNS-t használtunk. A 10 μL RT termékből 0,5 μL-t használtunk minden triplikált kvantitatív polimeráz láncreakcióhoz (PCR). A gyógynövények és virágok miRNS-szintjének számszerűsítéséhez 10 mg szárított növényi anyagot finom porrá őröltünk folyékony nitrogénben, majd RNS-izolálásnak vetettük alá miRNEASY kit (Qiagen) segítségével; 1 pmol szintetikus MIR161-et adtunk a növényi Qiazol-lizátumhoz exogén RNS-kontrollként. A qRT-PCR-t Biorad CFX96 valós idejű PCR detektáló rendszerrel végeztük, és az adatokat Biorad CFX szoftverrel elemeztük. A miRNS-ek relatív szintjének kiszámításához Delta-Delta-Ct módszert alkalmaztunk. A miRNS-ek abszolút koncentrációját a szintetikus miRNS-ek soros hígításaiból kapott standard görbék alapján számítottuk. A Taqman microRNS assay kit MIR2911 hűségének igazolásához a qPCR terméket agaróz géllel tisztítottuk, pGEM-T Easy vektorba (Promega) szubklónoztuk és szekvenáltuk [25].

Szintetikus miRNS-ek előállítása

Szintetikus miRNS-eket az Integrated DNA Technologies cégtől nyertünk. A miRNS-ek szekvenciája a következő volt: MIR-2911 5’-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3 ’; MIR-168a 5’-UCGCUUGGUGCAGAUCGGGAC-3 ”; MIR168a * 5’-CCCGCCUUGCACCAAGUGAAU-3 ”; C7 5’-GGAUCAUCUCAAGUCUUACGU3 ”; C7 * 5’-ACGUAAGACUUGAGAUGAUCC-3 ’; MIR156a 5’- UGACAGAAGAGAGAGAGACAC-3 ’; MIR161 5’- UCAAUGCAUUGAAAGUGACUA-3 ’(a csillag az utasszálat jelöli). A szoptatáshoz a miRNS-eket RNáz-mentes PBS-ben hígítottuk, és mindegyik állatot 400 pmol-mal etettük minden miRNS-ből 500 μl térfogatban. Farokvénás injekcióhoz a miRNS-eket hasonlóan hígítottuk PBS-ben, mindegyik egér 50 fmolt kapott 100 μl térfogatban.

AGO2 immuncsapadék

Immuncsapás céljából minden egyes szérummintából 250 μl-t inkubáltunk egy éjszakán át 4 ° C-on 3 μg egér monoklonális anti-AGO2 antitesttel (Santa Cruz Biotechnology), majd immunprecipitációt végeztünk 25 μl Protein L Agarose gyöngyökkel (Santa Cruz Biotechnology) 4 órán át. 4 ° C-on. A tisztítást követően az RNS-t kivontuk immunprecipitátumokból és a meg nem kötött frakciókból a miRNeasy Mini Kit (Qiagen) alkalmazásával, és 1 pmol szintetikus MIR161-et adtunk a Qiazol-lizátumokhoz exogén RNS-kontrollként. A miRNS-szinteket qRT-PCR-rel számszerűsítettük TaqMan mikroRNS-vizsgálatokkal, a fentiek szerint.

Székletbaktériumok tenyésztése

Az egér ürülékét lemértük és 1x PBS-ben homogenizáltuk 0,1 g/ml koncentrációig [26]. A széklet homogenizátumokat ezután sorosan hígítottuk, és szelekció nélkül Luria-húsleves lemezekre szélesztettük. A lemezeket egy éjszakán át 37 ° C-on inkubáltuk, megszámoltuk az inkubáció utáni telepszámot, és kiszámítottuk a baktériumok hozzávetőleges számát 1 gramm székletre vonatkozóan.

FITC-dextrán permeabilitási vizsgálat

A bélpermeabilitást FITC-dextran 4000 (Sigma) orális beadásával értékeltük. Az ételt és a vizet 4 órán át kivontuk, majd az egereket FITC-dextrán oldattal (60 mg/100 g testtömeg) szoptattuk. A szérumot 4 órával a szoptatás után összegyűjtöttük, és a FITC-dextrán méréseket kétszer végeztük fluorometriával (gerjesztés, 490 nm; emisszió, 530 nm; Cytofluor 2300, Millipore). A standard görbe kiszámításához a FITC-dextrán PBS-ben történt sorozatos hígításait használtuk.

Gyógyszeradagolás

A ciszplatint (Pfaltz és Bauer) steril 0,9% -os sóoldatban oldottuk 1 mg/ml koncentrációban. Az egereknek egyszeri intraperitoneális injekciót kaptak sóoldat vagy ciszplatin (15 mg/testtömeg-kg).

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzéseket a hallgatói T-Test képlettel végeztük a Microsoft Excel programban. A jelentőséget a P 1. táblázatban határoztuk meg. A MIR2911 tartalma különféle gyógynövényekben és virágokban.

A MIR2911 szintjének meghatározása különféle szárított gyógynövényekben és virágokban. A MIR2911 koncentráció kiszámítása egy standard görbén és az exogén MIR161-hez való normalizáláson alapul.

A növényi eredetű MIR2911 keringő szintje növényi étrenddel etetett állatokban

Őrölt gyógynövényekkel vagy virágokkal kiegészített módosított chow-alapú étrendet használva elemeztük a növényi eredetű MIR2911 szintet az egerek szérumában és vizeletében hét nappal az etetés megkezdése után. A keringő MIR2911-szintek közötti különbségek a növényi táplálékkal táplált állatokban a chow-val táplált állatokhoz viszonyítva a következők voltak: lonc, 39-szer magasabb (207 fM); kamilla, 27-szer magasabb (147 fM); sophora, 22-szer magasabb (120 fM); levendula, 13-szor magasabb (71 fM); kék mályva, 12-szer magasabb (64 fM); ginseng, ötször magasabb (25 fM). Nem észleltünk szignifikáns változást sem a hibiszkuszban (3 fM), sem a fűz kérgében (6 fM). A gyógynövényes táplálékkal táplált egerek vizeletmintáiban a MIR2911 szintjének többszörös különbségei a chow-hoz képest a következők voltak: lonc, 160-szor magasabb (264 fM); kamilla, 82-szer magasabb (135 fM); levendula, 17-szer magasabb (28 fM) (1. ábra). A MR2911 qRT-PCR vizsgálati készletének hűségének igazolásához olyan szérummintákkal, amelyekben viszonylag kis mennyiségű MIR2911 található, a qPCR terméket szubklónoztuk és szekvenáltuk. Megerősítették az érett MIR2911 teljes szekvenciájának jelenlétét a qPCR amplikonban.

(A) A MIR2911 kimutatása különböző gyógynövényes és virágos étrendet tápláló egerek szérumában. (B) A MIR2911 kimutatása különféle gyógynövényes és virágos étrendet tápláló egerek vizeletében. Az (A) és (B) esetében az egereket 7 napig tápláltuk, mielőtt az RNS-t izolálták a szérum- és vizeletmintákból, és elemezték. N = 5. Csillag: p 2. ábra: A szintetikus MIR2911 táplált szondával történő abszorpció időbeli elemzése A szérum MIR2911 szintjének időbeli elemzése 400 pmol szintetikus MIR2911-et tápláló egerekben 0,5 órával, 1 órával, 3 órával a szoptatás után.

Az egereket előre táplálták a chow-étrendet. N = 5. A kísérletet háromszor replikálták.

A szérum MIR2911 és az AGO2 kapcsolatának értékelése

A keringő kis RNS-ek ellenállnak az RNáz aktivitásának, a rendkívüli pH és hőmérséklet ingadozásoknak [27]. Ennek a védelemnek az egyik mechanizmusa az asszociáció egy RNS-kötő fehérjével, például az Argonaute 2-vel (AGO2) [6, 28]. Megvizsgáltuk a szérumokat annak meghatározására, hogy a MIR2911 társult-e AGO2-vel, anti-AGO2 antitestekkel történő ko-immunprecipitációval. Az immuncsapadék kimutatta, hogy a MIR2911 körülbelül 99% -a nem kapcsolódott az AGO2-hez, és a meg nem kötött frakcióban maradt, míg az immunogéncseppekben az endogén miR-16, valamint a gyógynövényes táplálékkal táplált állatok és a kontroll egerek szérumainak megkötetlen hányadát körülbelül azonos koncentrációban nyertük meg (3. ábra ).

(A) A MIR2911 mennyiségének meghatározása AGO2-vel társult immunprecipitátumokban és fűszernövény-alapú étrenddel vagy standard chow-étrenddel etetett állatok szérumának nem kötött frakcióiban. (B) a miR-16 immunprecipitációt endogén kontrollként elemeztük az AGO2 kicsapására. A MIR2911 és a miR-16 szintjét normalizáltuk a beillesztett exogén MIR161 szintre. Ez a kísérlet több mint öt különböző kísérletet reprezentál, amelyet növényi táplálékú egerekkel (lonc, kamilla) végeztek.

A keringő növényi alapú kis RNS-ek kiürítése

A kis RNS-ek in vivo bejuttatása számos kihívással szembesül, beleértve a szérum korlátozott stabilitását és a gyors vértisztulást [29]. Adataink azt sugallják, hogy az étrendi MIR2911 a szérumokban stabilizálódik az AGO2 megkötése nélkül (3. ábra). Vajon a MIR2911 másodlagos szerkezete védelmet nyújthat-e a szérumokban az RNáz aktivitással szemben? Ennek az elképzelésnek a teszteléséhez megvizsgáltuk a szintetikus növényi alapú kis RNS-ek közvetlenül a keringésből való eltávolítását. Négy különböző növényi alapú kis RNS (MIR2911, MIR168a, MIR156a és MIR161) koktélt és egyedi tervezésű siRNS MIRC7-et injektáltunk közvetlenül az egér farokvénájába, és az egerekből szérumokat gyűjtöttünk 5 perc, 30 perc, 1 óra múlva, 3 és 24 órával az injekció beadása után. Az intravénás dózis koncentrációja a bőséges keringési miRNS-ek, például a miR-16 koncentrációján alapul [19]. Ahogy számos korábbi jelentés dokumentálta [29, 30], ezeknek a kis RNS-eknek a kiürülése gyors volt. Érdekes módon a MIR2911 szintje lényegesen magasabb volt az injekció beadása után 5 perccel, összehasonlítva az azonos dózisban beadott többi miRNS-sel. 3 óra múlva az összes tesztelt kis RNS látszólagos tisztulása teljes volt (4. ábra).

A szérum mikroRNS szintjének időbeli elemzése mikroRNS koktél (egyenként 5 pmol) injekciót követően laterális farokvénán keresztül. 1x PBS-t injektáltunk kontrollként. A kísérlet több mint háromszor ismétlődött.

A bél mikrobiomjának hatása a MIR2911 abszorpciójára

A szérum MIR2911 szintjének elemzése egérrel táplált egérrel (HS), egérrel táplált egerekkel és antibiotikumokkal kezelt egerekkel (HS + Ab), valamint egerekkel etetett egerekkel. Az egereket 7 napig etették a táplálékkal, mielőtt a szérum MIR2911 szintjét elemezték. N = 5. A kísérlet több mint háromszor replikálódott az egyes diétákkal és állapotokkal.

A béláteresztő képesség számszerűsítése a lonc táplált állatokban

A lonc táplálkozás által okozott potenciális bélváltozások vizsgálatához, amelyek fokozhatják a kis RNS felvételt, permeabilitási próbaként a nem metabolizálható FITC-dextran 4000 makromolekulát használtuk [32]. A loncokkal táplált állatokban a bél hámgátjának integritását 4 kD-os FITC-dextrán molekulával szondával etető egerekkel és annak forgalomba történő transzlokációjának mérésével értékeltük. Nem találtunk különbséget a FITC-dextran áteresztőképességében a lonc-táplált állatokban a chow-val etetett állatokhoz képest. Ciszplatin-kezelést alkalmaztak pozitív kontrollként a fokozott permeabilitás érdekében, mivel ez a vegyszer ismerten elősegíti a bél fokozottabb permeabilitását [33] (6. ábra).

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Diéta" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "MicroRNS-ek" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Gyógynövények" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Áteresztőképesség" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Vizelet" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Mikrobiome" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Kis zavaró RNS" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Virágok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem