Határok az orvostudományban

Transzlációs orvoslás

Ez a cikk a kutatási téma része

Többfeladatos biomolekulák az emberi patológiákban: ismert játékosok váratlan utazásaikon Az összes (6) cikk megtekintése

Szerkesztette
Klaus T. Preissner

Giesseni Egyetem, Németország

Felülvizsgálta
Zhengzhao Liu

Xiangya Kórház, Közép-Déli Egyetem, Kína

Xiaoguang Li

A Johns Hopkins Kórház, Johns Hopkins Medicine, Egyesült Államok

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

circhipk3

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • II. Máj- és hasnyálmirigy-műtét osztály, Harmadik Hsziangya Kórház, Közép-Déli Egyetem, Csangsa, Kína

Bevezetés

Az akut hasnyálmirigy-gyulladás (AP) előfordulása és kialakulása a kutatások középpontjában állt a műtét területén (1). Az AP állapota, különösen a súlyos akut pancreatitis (SAP), veszélyes, és magas a halálozási aránya (2). Az AP korai szakaszában az aktivált hasnyálmirigy-enzimek, az oxigén szabad gyökök feleslege és a gyulladáscsökkentő citokinek az acináris sejtek károsodását és halálát okozzák (3). Az acináris sejtekben az SAP során bekövetkező halálozás típusai közé tartozik az apoptózis, a nekrózis és a piroptosis (4). Amikor az acináris sejtek főleg apoptotikusak, a klinikai megnyilvánulások enyhe ödémás hasnyálmirigy-gyulladás, amelynek jó prognózisa van (5). A piroptosis károsodásakor az acináris sejtek megrepednek, és felszabadítják a sejttartalmat és a gyulladásos faktorokat, például az alfa tumor nekrózis faktor (TNF-a) és az IL-1β, ami súlyosbítja a gyulladásos választ (6). Ezért ez az acináris sejtpusztulás mód mindig is forró pont volt az AP-kutatásban.

Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az acináris sejtek morfológiája az AP során a piroptosis jellemzőivel rendelkezik (7). A piroptosis egy kaszpáz-1/4/5/11 által közvetített programozott sejthalál (8). A kaszpáz-1 aktiváció az AP acináris sejtjeiben is jelen van, ami arra utal, hogy a piroptosis társul AP-vel (7). Az acináris sejtekben a piroptosis mechanizmusainak megértése új ötleteket nyújt az AP klinikai diagnosztizálásához és kezeléséhez.

A körkörös RNS-ek (circRNS-ek) az egyedülálló zárt hurkú szerkezettel rendelkező RNS-ek olyan osztálya, amelyek stabilan expresszálódnak sok biológiai sejtben (9 Vizsgálatok azt találták, hogy a circRNS-ek különböző szinteken szabályozhatják a génexpresszió szintjét azáltal, hogy kötődnek a miRNS-ekhez és fehérjékhez, valamint szabályozzák a fehérje transzlációját és módosulását, és számos biológiai folyamatban vesznek részt, például a sejtek differenciálódásában, a proliferációban és az apoptózisban (10, 11). Ezért az circRNS-ek fontos szabályozó szerepet játszanak olyan betegségek kialakulásában, mint a szív- és érrendszeri betegségek, a daganatok és az autoimmun betegségek (12). Például a circRNS-kaszpáz-1-hez társított circRNS-t (CACR) a magas glükózzal kezelt kardiomiocitákban szabályozzák felül. A CACR csendesítés gátolja a magas glükóz által kiváltott kaszpáz-1 aktivációt és a piroptosist a kardiomiocitákban (11), ami arra utal, hogy a circRNS-ek összefüggenek a piroptosissal.

Ebben a tanulmányban a circHIPK3 szerepére és mögöttes mechanizmusára összpontosítottunk AP-ban. A circHIPK3 (hsa_circ 0000284) egy kör alakú RNS, amely a HIPK3 gén második exonjából származik. A circHIPK3 magasan expresszálódik a májban, az agyban és a tüdőben (13–15), és fontos szerepet játszott a sejtek túlélésének, az oxidatív károsodásnak és a gyulladásnak a szabályozásában (16–18). Megjegyezzük, hogy a circHIPK3 a hasnyálmirigy szövetében is expresszálódik (19). Ezenkívül a circHIPK3 csendesítésről kimutatták, hogy gátolja az IL-1β és a TNF-a felszabadulását, ami szoros kapcsolatot mutat a circHIPK3 és az AP gyulladása között (20). Azonban a circHIPK3 szerepe és mechanizmusa AP-ben továbbra sem világos. Ebben a tanulmányban eredményeink azt mutatták, hogy a circHIPK3 magasan expresszálódott az AP-betegek szérumában és a caerulein-stimulált AR42J sejtekben. Ezenkívül bebizonyítottuk, hogy a circHIPK3 elnémítása gyengítette a caerulein által közvetített piroptosist AR42J sejtekben. Továbbá, a mechanisztikus tanulmány kimutatta, hogy a circHIPK3 elősegítette a piroptosist és a gyulladást a miR-193a-5p/GSDMD tengely szabályozásával az AR42J sejtekben. Ezért a circHIPK3 új biomarkerré és terápiás célponttá válhat az AP-ban.

Anyagok és metódusok

Emberi mintagyűjtemény

A 2017. március és 2018. december közötti időszakban összesen 72 akut hasnyálmirigy-gyulladásban szenvedő beteget (50 férfit és 22 nőt; életkor: 30–72 év; átlagéletkor: 48,3 év) vontak be a vizsgálatba. Az AP diagnózisának diagnosztikai kritériuma a következő két feltétel teljesítése: (1) akut, tartós, súlyos és elviselhetetlen felső hasi fájdalom, amely gyakran a hátába sugárzik; (2) a szérum amiláz- és/vagy lipázaktivitás háromszor vagy annál magasabb a normál felső határnál; (3) fokozott CT/MRI vagy hasi ultrahang mutatta az AP képalkotás változását.

A MAP diagnózis diagnosztikai kritériumainak meg kell felelniük a fenti AP diagnózisnak és a következő feltételek egyikének: (1) nincs szervi diszfunkció, nincsenek szövődmények, Ranson 6 AR42J sejtet vetett be 6-lyukú lemezekre 80% -os összefolyásig, majd transzfektálták. A circHIPK3 szelektív célzása érdekében a circHIPK3 shRNS-szekvenciáit a fej-farok kereszteződésnél (backsplice junction) terveztük, hogy elkerüljük a lineáris mRNS-hez történő komplementer párosulást (7-mer mag nincs jelen a lineáris gazda génben). A kontroll szekvenciát a backsplice kereszteződés egyik végén illesztettük össze, a másik végén pedig nem. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott shRNS-szekvenciát a GenePharma (Sanghaj, Kína) szintetizálta, és hU6-MCS-PGK-EGFP lentivirális vektorba (GenePharma, Shanghai, Kína) csomagolta. A fertőzés sokasága 100. A transzfekció hatékonyságát FACScalibur áramlási citometriával (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) határoztuk meg, 90% feletti transzfekciós hatékonysággal. A miRNS-gátló és utánzó transzfekcióhoz a miR-193a-5p-gátlót és utánzatot a Guangzhou Ribo Biotech-től (Guangzhou, Kína) szereztük be és transzfektáltuk a gyártó utasításainak megfelelően.

Mennyiségi polimeráz láncreakció

A teljes RNS-t kivontuk a sejtekből, majd reverz transzkripcióval komplementer DNS (cDNS) előállításához nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készletet használva (Applied Biosystems, Kalifornia). A miRNS cDNS-jét a TaqMan miRNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával állítottuk elő (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). Ezt követően qPCR-t használtunk a circHIPK3, HIPK3 és GSDMD expressziójának detektálására TaqMan géndetektáló készlettel, vagy a miR-30a, miR-124 és miR-193a-5p expressziót TaqMan Universal Master Mix II alkalmazásával detektáltuk. Mivel a kör alakú RNS rezisztens az RNáz R-re, RNáz R-kezelést használtunk a lineáris PCR-termékek körkörös RNS-re gyakorolt ​​hatásának csökkentésére. Az RNS és a miRNS belső kontrolljaként a GAPDH-t és az U6-ot használtuk. A következő primereket alkalmaztuk: circHIPK3, előre 5'-TGGAGACTGGGGGAAGATGA-3 'és fordított 5'-CACACTAACTGGCTGAGGGG-3'; HIPK3, előre 5'-GACCTGAGGAGATCAAGCCG-3 'és hátramenet 5'-ACTCCTCACTCTTGCGCTTC-3'; GSDMD, előre 5'-CTCGCCGACTTCCGTAAACT-3 'és hátramenet 5'-TCCAGCGATCCTGGGTTCTA-3'; GAPDH, előre 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 ′ és hátramenet 5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 ′.

Enzimhez kapcsolt immunvizsgálat (ELISA)

Az IL-1β, IL-6, IL-8 és TNF-a koncentrációit kereskedelmi forgalomban enzimhez kapcsolt immunvizsgálati készlettel (ELISA, Sangon Biotech) határoztuk meg a gyártó által megadott eljárásnak megfelelően. Az eredményeket pikogrammokban/milliliterben fejezzük ki. Az amiláz enzim aktivitást egy kereskedelemben kapható enzimhez kapcsolt immunvizsgálati készlettel (kat. K711-100, BioVision) is meghatároztuk a gyártó által megadott eljárásnak megfelelően.

Propidium-jodid festés

A propidium-jodid (PI) nem képes behatolni az ép sejtmembránokba, így a normál sejteket vagy az ép sejtmembránokkal rendelkező apoptotikus sejteket nem lehet festeni. A PI azonban megfesti azokat a piroptotikus sejteket, amelyek elvesztették a sejtmembránok integritását. Röviden, az AR42J sejteket takarólemezeken tenyésztettük a tapadás és a 80% -os összefolyás érdekében. A sejteket PBS-ben mostuk és előre lehűtött 70% -os etanolban rögzítettük 30 percig 4 ° C-on, majd 20 percig 50 μl ribonukleázzal (100 μg/ml) kezeltük. Végül 200 μl PI-t (végkoncentráció 50 μg/ml, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína) adtunk hozzá, hogy 30 percig sötétben inkubáljuk, majd a PI festést fluoreszcens mikroszkóppal figyeltük meg, és a PI-pozitív sejteket lefényképezték és megszámolták.

Áramlási citometria

Az AR42J sejteket caeruleinnel kezeltük 8 órán át. A kezeletlen sejteket használtuk kontrollként. 2% (tömeg/térfogat) FBS-t tartalmazó PBS-sel végzett intenzív mosás után a sejteket fluorokróm-konjugált antitestekkel festettük [az anti-kaszpáz-1 (AG-20B-0042-C100) az Adipogen cégtől származik; az anti-kaszpáz-11 (NB120-10454) a Novus cégtől származik FACS elemzés céljából. Az összes áramlási citometriát FACScalibur áramlási citométeren (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) végeztük, és az adatokat a FlowJo 7.6.1 szoftverrel elemeztük.

Dual-Luciferase Reporter Gene Assay

A GSDMD vad típusú 3′UTR-t és 3′UTR mutánsát a Sangon Biotech szintetizálta a Helyre irányított mutagenezis készlet segítségével (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, Kína), és beillesztettük a pGL3-LUC jelentés vektorba. (Promega). 2 × 105 AR42J sejt mintáját 12 órán át 24 lyukú lemezekre oltottuk, és 100 ng vakvektort vagy GSDMD WT 3'UTR és MUT 3 'UTR vektorokat és 400 ng LUC riportervektort együtt transzfektáltunk a sejteket 48 órán át. 48 óra transzfekció után a sejteket összegyűjtöttük, és a gyártó utasításainak megfelelően Dual-Luciferase Assay (Promega) alkalmazásával megvizsgáltuk a luciferáz aktivitást. Kontrollként kontrollként a pRL-TK Renilla Luciferase Reporter Vektorral (Promega) való együttes transzfekciót alkalmaztuk.

Western Blot elemzés

A kezelt sejteket 1 mM DTT-t, 11 μg/ml DNáz I-t és proteáz-inhibitor koktélt (Roche) tartalmazó RIPA pufferben lizáltuk, és jégen inkubáltuk 30 percig. Hatvan mikrogramm fehérjemintát választottunk el elektroforézissel egy denaturált 10% -os SDS-PAGE gélen, és PVDF membránra (Millipore) blottoltunk. Az elsődleges antitestek (Anti-Caspase-1, 1: 1 000, ab138483, Abcam; Anti-cleavage Caspase-1, 1: 1 000, ab207802, Abcam; Anti-Caspase-11, 1: 1 000, ab22684, Abcam hasítás elleni Caspase -11, 1: 1 000, ab180673, Abcam) éjszakán át 4 ° C-on inkubáltuk. A GAPDH-hoz monoklonális nyulat (EPR 16891, Abcam) használtuk terhelés kontrollként. Ezt követően a membránokat leöblítették, majd megfelelő szekunder antitestekkel inkubálták. ECL készletet (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína) használtunk a Western blotok sávjának kimutatására.

CCK-8 A sejtek életképességének elemzése

A sejtek életképességi vizsgálata céljából a transzfektált sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk (3000 sejt/üreg), és a sejtek életképességét CCK-8 készlet (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína) segítségével értékeltük a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden, a transzfekció után a sejteket 96 lyukú lemezekre oltottuk (3000 sejt/üreg) és 24 órán át tenyésztettük. Ezután 10 μl CCK-8 oldatot adunk a sejttenyésztő tápközeghez, és további 4 órán át inkubáljuk. Abszorpciót 450 nm hullámhosszon detektáltunk egy mikrolemez-olvasóban (ELx808, BioTek, USA).

Statisztikai analízis

Ebben a vizsgálatban minden kísérletet háromszor megismételtünk egymástól függetlenül. Az adatokat átlag ± szórásként (SD) fejezzük ki. Az adatok elemzéséhez az SPSS Statistics 20.0 szoftvert (IBM, Armonk, NY, USA) használtuk. Variancia vagy kétfarkú Student elemzése t-tesztet használtunk a csoportok közötti különbségek kiszámításához. P + PI + sejtek AR42J sejtekben caerulein kezelés után. Az adatokat reprezentatív diagramként (felső) és számszerűsített százalékban (alsó) mutatjuk be. (H) A circHIPK3 expresszióját qPCR segítségével határoztuk meg AR42J sejtekben caerulein kezelés után. *o + propidium-jodid (PI) + sejtek kapuk az AR42J sejteken, amelyeket 8 órán át kezeltek caeruleinnal a kontrollhoz képest ((58,5 vs. 4,2%), 1G ábra). Ezenkívül megvizsgáltuk a circHIPK3 expressziós szintjét, és megfigyeltük, hogy a caerulein-kezelés időfüggő módon jelentősen növelte a circHIPK3 expresszióját (1H ábra). Mivel a caerulein által kiváltott AR42J sejtek károsodása a legszembetűnőbb a 8 órás időpontban volt, ezt az időpontot választották ki a későbbi kísérletekhez. Ezek az adatok együttesen azt sugallják, hogy a circHIPK3 és a piroptosis akut hasnyálmirigy-gyulladással társul.

A circHIPK3 expresszió némítása csillapítja a Caerulein által kiváltott károsodást az AR42J sejtekben

Annak érdekében, hogy feltárjuk a circHIPK3 AP-ra gyakorolt ​​hatását, elhallgattattuk a circHIPK3-t AR42J sejtekben interferencia szekvenciákkal teli lentivírussal, majd Caeruleinnal stimuláltuk az AR42J sejteket. Az shRNS transzfekciója szignifikánsan csökkentette a circHIPK3 szintjét a keverési csoporthoz képest (2A. ábra), de nem változtatta meg a HIPK3 gazda gén expresszióját (S1. ábra). A későbbi kísérletek azt mutatták, hogy a circHIPK3 elnémítása növelte a sejtek életképességét (2B. Ábra) és csökkentette a PI-pozitív sejtek számát (2C. Ábra), elnyomta az amiláz aktivitást (2D. Ábra), és gátolta az IL-1β, IL-6 gyulladásos citokinek szekrécióját., IL-8 és TNF-a (2E. Ábra). Ezenkívül a circHIPK3 elnémítása jelentősen csökkentette a hasított kaszpáz-1 és a kaszpáz-11 expresszióját. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a circHIPK3 elnémítása szignifikánsan gyengíti a caerulein által kiváltott károsodást az AR42J sejtekben, és piroptosissal társul.

2. ábra. A circHIPK3 leütés gátolja a caerulein által közvetített sejthalált az AR42J sejtekben. (A) A circHIPK3 szinteket qPCR-rel elemeztük shRNS transzfekció után AR42J sejtekben. (B) CCK8 vizsgálatot végeztek a sejt életképességének mérésére AR42J sejtekben caerulein-kezelés után vagy shRNS-transzfekcióval. (C) PI festést végeztünk a sejtek piroptosisának meghatározására caerulein kezelés után vagy shRNS transzfekcióval AR42J sejtekben. (D) Az amiláz aktivitást ELISA kit segítségével mértük caerulein kezelés után, vagy shRNS transzfekcióval AR42J sejtekben. (E) Az IL-1β, IL-6, IL-8 és TNF-a gyulladásos citokinek szintjét ELISA kitekkel mértük táptalajban caerulein-kezelés után vagy shRNS-transzfekcióval. (F) A piroptosissal kapcsolatos fehérjék, a kaszpáz 1 és a kaszpáz 11 elemzését immunoblot-analízissel végeztük caerulein-kezelés után, vagy shRNS-transzfekcióval AR42J sejtekben (balra), és a sávokat kvantifikáltuk (jobbra). *o Kulcsszavak: akut hasnyálmirigy-gyulladás, körkörös RNS, piroptosis, mikroRNS, gasdermin család

Idézet: Wang J, Li X, Liu Y, Peng C, Zhu H, Tu G, Yu X és Li Z (2020) CircHIPK3 elősegíti a piroptosist az acináris sejtekben a miR-193a-5p/GSDMD tengely szabályozásával. Elülső. Med. 7:88. doi: 10.3389/fmed.2020.00088

Beérkezett: 2019. november 28 .; Elfogadva: 2020. március 02 .;
Publikálva: 2020. április 07.

Klaus T. Preissner, Giessen-i Egyetem, Németország

Xiaoguang Li, Johns Hopkins Medicine, Egyesült Államok
Zhengzhao Liu, Közép-Déli Egyetem, Kína