A tea a tirozin-foszfatáz PTP1B hatásos inhibitorait tartalmazza

Junfeng Ma

1 Pathology Department, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104

2 Edmond H. Fischer jelátviteli laboratórium, Élettudományi Főiskola, Jilin Egyetem, Changchun, 130012, Kína

Zhe Li

1 Pathology Department, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104

Shu Xing

1 Pathology Department, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104

2 Edmond H. Fischer jelátviteli laboratórium, Élettudományi Főiskola, Jilin Egyetem, Changchun, 130012, Kína

Tina Ho-t akarja

1 Pathology Department, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104

Xueqi Fu

2 Edmond H. Fischer jelátviteli laboratórium, Élettudományi Főiskola, Jilin Egyetem, Changchun, 130012, Kína

Zhizhuang Joe Zhao

1 Pathology Department, University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma 73104

2 Edmond H. Fischer jeltovábbító laboratórium, Élettudományi Főiskola, Jilin Egyetem, Changchun, 130012, Kína

Absztrakt

A teát széles körben fogyasztják az egész világon. Tanulmányok bebizonyították a tea szerepét a különböző krónikus betegségek, köztük a cukorbetegség és az elhízás megelőzésében és kezelésében, de a mögöttes mechanizmus nem világos. A PTP1B egy széles körben expresszált tirozin-foszfatáz, amelyet a cukorbetegség és az elhízás kezelésére szolgáló terápiás gyógyszerfejlesztés célpontjaként határoztak meg. A PTP1B inhibitorainak szűrése során azt tapasztaltuk, hogy a teák vizes kivonatai hatásos PTP1B gátló hatást mutattak, az IC50 értéke 0,4–4 g száraz tealevél/liter víz. A fekete tea mutatja a legerősebb gátló aktivitást, ezt követi az oolong, majd a zöld tea. A biokémiai frakcionálások kimutatták, hogy a tea legfontosabb hatékony komponensei megfelelnek az oxidált polifenolos vegyületeknek. Ezt tovább igazolta az a tény, hogy a tea katechinek a tirozinázok által katalizált oxidáció hatására a PTP1B hatékony inhibitorai lettek. A tenyésztett sejtekre alkalmazva a teakivonatok a sejtfehérjék tirozin-foszforilációját indukálták. Vizsgálatunk azt sugallja, hogy a tea néhány jótékony hatása a PTP1B gátlásának tulajdonítható.

Bevezetés

A cukorbetegség elleni és elhízás elleni gyógyszerek célpontjaként a PTP1B fényében különféle gyógynövénytermékeket vizsgáltunk meg a PTP1B gátlására való képességük szempontjából. Vizsgálatunkból kiderült, hogy a tea, különösen a fekete tea, erős PTP1B gátló aktivitást tartalmaz.

Anyagok és metódusok

Anyagok

A PTP1B és a TC-PTP katalitikus doménjeit tartalmazó rekombináns fehérjéket képviselő ΔPTP1B-t és ΔTC-PTP-t rekombináns E. coli sejtekből tisztítottuk, ahogy azt korábban más PTP-k katalitikus doménjére leírtuk [37, 38]. A PTP szubsztrát para-nitrofenil-foszfátot (p-NPP), (-) - epigallocatechin-gallátot (EGCG), (-) - gallocatechin-gallátot (GCG), gomba-tirozinázt, szarvasmarha-szérum-albumint, puffereket és sókat a Sigma-Aldrich cégtől kaptuk. A fordított fázisú C18 oszlopot a Waters Corporation-től szereztük be. Az összes teát a helyi piacokról vásárolták.

Teakivonatok készítése

A deionos víz felhasználása kivételével teakivonatokat (infúziókat) készítettek úgy, ahogy a szokásos ivó teát készítették. Röviden, 0,2 g száraz tealevelet adtunk egy üvegcsőben lévő 5 ml forrásban lévő vízhez, és 20 percig 95 ° C-on hevítőtömbön tartottuk. Szobahőmérsékletre lehűlés után a felülúszót összegyűjtöttük, és az esetleges törmelékeket centrifugálással eltávolítottuk. A nyers extraktumok koncentrációját 40 g/l-nek határoztuk meg. Vegye figyelembe, hogy az extraktumban az oldott anyagok valódi koncentrációja lényegesen kisebb, mivel a tealevelek jelentős része oldhatatlan. A teakivonatok ez a koncentrációja megegyezik a szokásos ivóteákkal.

PTP aktivitási vizsgálatok

A PTP aktivitás vizsgálati rendszer 25 mM MOPS-NaOH-t (pH 7,0), 1 mM EDTA-t, 1 mM ditiotreitolt, 1 mg/ml szarvasmarha-szérum albumint, 0,1 M NaCl-ot, 10 mM p-NPP-t és 40 nM rekombináns ΔPTP1B vagy ΔTC- PTP. A vizsgálatokat 100 μl össztérfogatban, legfeljebb 10 μl teakivonattal végeztük szobahőmérsékleten 10 percig. A reakciókat 800 μl 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonát hozzáadásával állítottuk le, és 410 nm-en abszorbancia értéket mértünk, hogy meghatározzuk a para-nitrofenolt. Egy vak tesztet futtattunk enzimek nélkül. A PTP-aktivitás egy egységét percenként 1 nmol foszfát-felszabadulásként határozzuk meg. Az IC50-érték az inhibitorok azon koncentrációjára vonatkozik, amelynél a PTP-ket 50% -kal gátolják. Az egyik PTP-gátló egységet úgy definiáljuk, mint az inhibitorok mennyiségét, amely szükséges ahhoz, hogy a vizsgálati rendszerünkben a PTP1B aktivitása 50% -kal csökkenjen.

Teakivonatok frakcionálása

Fordított fázisú C18 oszlopot alkalmaztunk a teakivonatok frakcionálására a PTP-gátló aktivitás gazdagítása érdekében. A teakivonatokat a vízzel kiegyensúlyozott oszlopra töltöttük, majd 0–100% metanol gradienssel eluáltuk. Mindegyik frakció abszorbanciáját 450 nm-nél ellenőriztük, és elemeztük a PTP1B gátló aktivitását a fent leírtak szerint.

A teakivonatok és a tea katechinek tirozináz által katalizált oxidációja

Tirozinázt alkalmaztunk teakivonatok és izolált teakatechinek oxidálására. Ez lényegében utánozza a tea erjedése során lejátszódó folyamatot. Röviden, a teakivonatokat, az EGCG-t és a GCG-t gombás tirozinázzal kezeltük a fent említett PTP vizsgálati pufferben, szobahőmérsékleten, különböző ideig. A termékeket közvetlenül használtuk PTP-gátlási vizsgálatokhoz a fentiek szerint.

Sejtkultúra és stimulálás teakivonatokkal

Az NIH-3T3 sejteket csaknem összefolyásig tenyésztettük 10% fatális szarvasmarha szérummal kiegészített DMEM táptalajban. A sejteket ezután különféle teakivonatokkal kezeltük. 30 perces inkubálás után a sejteket egy teljes sejt extrakciós pufferben extraháltuk, amely 25 mM β-glicerofoszfátot (pH 7,3), 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM β-merkaptoetanolt, 1% Triton X-100, 0,1 M NaCl-ot tartalmazott. és egy proteáz inhibitor keveréket (Roche Applied Science). 10 percig 14 000 x g sebességgel végzett centrifugálás után a felülúszókat 10% -os SDS poliakrilamid gélen oldjuk, és polivinilidén-fluorid (PVDF) membránra visszük Western blot elemzés céljából anti-foszfotirozin antitesttel. A detektálást fokozott kemilumineszcencia (ECL) módszerrel végeztük.

Eredmények

A teakivonatok erős PTP1B gátló aktivitást tartalmaznak

Rekombináns E. coli sejtekből tisztítottuk meg a ΔPTP1B-t, nevezetesen a PTP1B katalitikus doménjét. A tisztított enzim lényegében homogén volt, és fajlagos aktivitása 17 000 egység/mg volt a vizsgálati körülmények között, pH 7,0 mellett. A PTP vizsgálati pufferünk 50 mM MOPS-NaOH-ot és 0,1 M NaCl-ot tartalmazott a fiziológiai ionerősség utánzására. A rekombináns ΔPTP1B segítségével sokféle teát vizsgáltunk gátló hatások szempontjából. Ezeket a teákat vízzel készítették, hasonlóan az ivóteák főzéséhez. Enyhén savasak voltak (pH 6–7). A vizsgálati rendszerhez adva nem okoztak pH-változást. Az 1A. Ábra a 12 teával kapott PTP aktivitási vizsgálatok eredményeit mutatja. Mindegyikük PTP1B gátló aktivitást mutatott, a fekete a legerősebb aktivitást követte, az oolong tea, majd a zöld tea. A különféle teák IC50-értékeinek összehasonlítását szemlélteti az 1B. Ábra. 4 fekete tea átlagos IC50-értéke 0,4 g/l körül volt, ami megfelel az eredeti teakivonatok 100-szorosának. Az ololong és a zöld teák átlagos IC50-értéke 2, illetve 4 g/l volt.

A. A ΔPTP1B aktivitását 11 különböző tea (3 piros, 2 oolong és 6 zöld) jelzett koncentrációinak jelenlétében elemeztük. B. Az IC50 értékeket úgy határoztuk meg, hogy elemeztük a ΔPTP1B aktivitását a teák különböző koncentrációiban. Az adatok az egyes teafajták átlagos IC50-értékeit mutatják. C. A ΔPTP1B és ΔTC-PTP aktivitását fekete és zöld tea jelzett koncentrációinak jelenlétében elemeztük. A PTP aktivitási vizsgálatokat enzimek hozzáadásával kezdtük meg. A hibasávok a szórást jelzik (n ≥ 3, hacsak másként nem jelezzük).

Annak megállapítására, hogy a teák gátló aktivitása rendelkezik-e szelektivitással a PTP1B-vel szemben, párhuzamosan elemeztük a TC-PTP aktivitását. Az összes klasszikus PTP közül a PTP1B osztja a legnagyobb homológiát a TC-PTP-vel, amely 54% azonosságot és 70% hasonlóságot mutat az aminosavszekvenciákban. A ΔPTP1B-hez hasonló stratégiát követve rekombináns E. coli sejtekből izoláltuk a TC-PTP katalitikus doménjét ΔTC-PTP-t. A tisztított ΔTC-PTP specifikus katalitikus aktivitást mutatott, összehasonlítva a ΔPTP1B-vel. Érdekes módon a ΔTC-PTP rezisztensnek tűnt mind a fekete, mind a zöld kivonatok gátlásával szemben, az IC50-értékek legalább 20-szor magasabbak, mint a ΔPTP1B esetében (1C. Ábra). Ezek az adatok azt bizonyították, hogy a teakivonatok szelektíven gátolják a PTP1B-t.

A teakivonatok PTP-vel történő előzetes inkubálása fokozza a gátló hatásokat

A PTP1B teakivonatokkal történő gátlásának kinetikai mechanizmusa bonyolultnak tűnt. Egyrészt a versenyképesség bizonyos tulajdonságait mutatja, mivel a szubsztrátkoncentráció megváltoztatása megváltoztatta a gátlás mértékét, de ez nem követi a tipikus kompetitív gátlási mintát (az adatokat nem mutatjuk be). Másrészt az enzim előzetes inkubálása a teakivonatokkal jelentősen fokozta a gátló hatásokat (2. ábra), ami arra utal, hogy lassan kötődnek az enzimhez, vagy kémiai módosításokhoz. Azt is észrevettük, hogy a redukáló reagens ditiotreitol koncentrációjának csökkentése növelte a teakivonatok iránti érzékenységet, ami az esetleges oxidációs reakciók részvételére utal.

A APTP1B-t 1 g/l-es fekete tea kivonattal vagy 3 g/l zöld tea kivonattal előre inkubáltuk a megadott ideig. A PTP aktivitási vizsgálatokat pNPP szubsztrát hozzáadásával kezdtük meg. Az adatok a relatív fennmaradó PTP-aktivitást jelentik, a hibasávok pedig a szórást (n = 3).

A teakivonatok PTP1B gátló aktivitása együtt mozog a tea színének intenzitásával a fordított fázisú kromatográfián

A teakivonatokban lévő hatékony komponensek elkülönítéséhez C18 reverz fázisú kromatográfiás oszlopokon frakcionáltuk őket. A megtöltött oszlopok metanollal történő eluálásával gazdagítani tudtuk a gátló aktivitást. Amikor a leghatékonyabb frakciókat megszárítottuk, súlyoztuk és vízben újra feloldottuk, 50 mg oldott anyag/liter víz IC50-értékét láthattuk, összehasonlítva az eredeti zöld teában mért 4 g száraz teával/l. Érdekes módon a PTP-gátló aktivitás együtt vándorolt a teafrakciók sárga/piros színével, amint azt az abszorbancia 450 nm-nél mutatja (3A. Ábra). Az egyszerűség kedvéért a 3A. Ábra csak a zöld tea kivonatokkal kapott adatokat szemlélteti. Hasonló eredményeket tapasztaltunk a fekete és az oolong teákkal is. Az adatok együttesen lényegében megmagyarázzák, hogy a fekete tea kivonatok miért mutattak mélyebb színt és így magasabb PTP1B gátló aktivitással rendelkeztek, mint a zöld tea kivonatok.

A. A zöld tea kivonatokat egy vízzel kiegyensúlyozott C18 oszlopra töltöttük. Vízzel történő mosás után az oszlopot 0-100% metanol gradienssel eluáljuk. A kiválasztott frakciók PTP1B gátló aktivitását megmértük és egység/ml-ben fejeztük ki. Megmértük az egyes frakciók abszorbanciáját 450 nm-en, amely egybeesik a piros/sárga színnel. B. A fekete tea kivonatokat 0,5 mg/ml koncentrációban, a zöld tea kivonatokat 1 mg/ml koncentrációban, 50 μM EGCG-t és 50 μM GCG-t inkubáltuk 5 egység tirozinázzal a PTP vizsgálati pufferben (25 mM MOPS-NaOH, pH 7,0, 1 mM ditiotreitol, 1 mg/ml szarvasmarha szérumalbumin, 0,1 M nátrium-klorid) 0, 1 és 10 órán át. A PTP vizsgálatokat pNPP és ΔPTP1B hozzáadásával kezdtük meg. A hibasávok a szórást jelzik (n = 3).

A teakivonatok és a katechinek tirozináz által katalizált oxidációja PTP1B gátló aktivitást generál

A teakivonatok a sejtfehérjék tirozin-foszforilációját indukálják a tenyésztett sejtekben

A PTP aktivitásának gátlásával a teakivonatok feltehetően növelik a fehérje tirozin foszforilációját. Annak megállapítására, hogy ez valóban így van-e, az NIH3T3 sejteket teakivonatokkal kezeltük 30 percig. A sejtkivonatok Western-blot-analízise során kiderült, hogy a teák mindhárom típusa a sejtfehérjék erős tirozin-foszforilációját indukálhatja (4. ábra). Ezen fehérjék azonosságát meg kell határozni. Ismert, hogy a PTP1B fő PTP-t képvisel az NIH-3T3 sejtekben [39]. Elképzelhető, hogy a PTP1B gátlása legalább részben felelős a fokozott tirozin-foszforilációért. Az ezekben a kísérletekben használt teakivonatok koncentrációi egyenértékűek voltak a 20-szor hígított ivóteákkal.

Az NIH-3T3 sejteket 2 ml teljes tápközegben majdnem összefolyásig növesztettük, majd 0,1 ml teakivonatot (5 g/l) vagy vizet adtunk hozzá. A sejteket 30 percig tovább tenyésztettük, majd egy teljes sejt extrakciós pufferben extraháltuk. Az összes fehérje azonos mennyiségét Western-blot-analízisnek vetettük alá anti-foszfotirizinnel (4G10) és anti-aktin antitestekkel. A nyilak azokat a fehérjéket jelzik, amelyek foszforilációját a teakivonatok jelentősen kiváltják.

Vita

Vizsgálatunk kimutatta, hogy a teakivonatok gátolják a PTP1B-t, IC-értéke 0,4–4 g száraz tea levél/liter víz. Ezek a koncentrációk a rendszeres ivóteák 10–100-szoros hígításainak felelnek meg, amelyek koncentrációja 4–40 g/l. Feltételezve, hogy az összes aktív komponens bejuthat a keringésbe, könnyen elérhető az a teák mennyisége, amely szükséges az emberi test hatékony PTP1B gátlási koncentrációjának eléréséhez. Ezer különböző flavonoidot azonosítottak a teában [22]. Ezek egy része kívánatos és jótékony hatással van az egészségre, néhány pedig nem. A cukorbetegség és az elhízás megelőzésére vagy kezelésére szolgáló teaalapú terápiás gyógyszerek vagy étrend-kiegészítők előállításához egyes összetevőket, például a koffeint, el kell távolítani, míg más komponenseket, például a PTP1B-gátló katechineket gazdagítani, módosítani és megfogalmazni kell a javulás érdekében. hatékonyság. Mivel a PTP1B a célpont, tanulmányunk mindkét biokémiai vizsgálatot biztosítja a hatékony komponensek elkülönítésére a további terápiás gyógyszerfejlesztéshez.

Meggyőző bizonyíték támasztja alá a teák jótékony szerepét a cukorbetegség és az elhízás megelőzésében és kezelésében. Ezt részben a PTP1B gátlása közvetítheti, amely egy jól bevált cukorbetegség és elhízás elleni gyógyszer célpont. Érdekes módon a fekete teák több tanulmány szerint hatékonyabbnak tűntek, mint a zöld teák [35, 36]. Ez egybevág azzal a megfigyeléssel, hogy a fekete teák magasabb PTP1B gátló aktivitással rendelkeznek.

Az előrejelzések szerint az amerikai felnőtt lakosság cukorbetegséggel sújtott százaléka a 2010. évi 14% -ról 2050-re 21% -ra nő [40]. Az elhízás aránya várhatóan 42% -ot fog elérni 2050-ig az Egyesült Államokban [41]. Az ilyen hatalmas közegészségügyi problémákkal több oldalról is küzdeni kell a kábítószer-bevitel szabályozása, a tápláló ételek és italok kiválasztása, valamint az egészséges életmód fenntartása révén. A tea, a természet ajándéka az emberiség számára, mindezen frontokon képviselteti magát. A tea PTP1B-re kifejtett gátló hatásának vizsgálata új arzenált biztosít a cukorbetegség és az elhízás elleni harcban.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a HL076309 és a> HL079441 támogatások támogatták az Amerikai Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézetétől (ZJ Zhao részére), valamint a Kínai Jilin tartományban található Tudomány és technológia fejlesztési tervének 20090920 számú támogatását (X Fu-nak).